细胞支原体污染(mycoplasma contamination)的PCR检测
易生物实验 · 2010/02/08
支原体菌株来源: M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体 M.FermentaneATCC19989 发酵支原体 M.SalivariumATCC23064唾液支原体 M.HominisATCC23114人型支原体 M.OraleATCC23714口腔支

支原体菌株来源:

M.Arginini ATCC23838 精氨酸支原体

M.FermentaneATCC19989 发酵支原体

M.SalivariumATCC23064唾液支原体

M.HominisATCC23114人型支原体

M.OraleATCC23714口腔支原体

M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体

其共同引物序列来自16s和23s保守区域,外部引物为F1 5′-ACACCATGGGAGCTGGTAAT-3′,R1 5′-GTTCATCGACTTTCAGACCCAAGGCAT-3′;内部引物为 F2 5′-GTTCTTTGAAAACTGAAT-3′,R2 5′-GCATCCACCAAAAACTCT-3′。

PCR反应体系和条件:10×缓冲液(10mMTris-HCl、500mMKCl、20mMMgCl2、0.01%明胶)、PrimerF1、R1、F2、R2的浓度为2nmol/μL、2.5mMdNTPs、Taq酶、H2O、石蜡油覆盖。反应温度和时间为:94℃ /2min预变性、94℃/30s变性、55℃/1min退火、72℃/1min延伸,循环30次后72℃延伸5min。第1次PCR反应取模板 10μL,第2次PCR反应以第1次PCR扩增产物为模板取1μL。

下面是更详细的:

污染测试——支原体:PCR方法

原理: 利用具特殊专一性之primers,经由PCR反应来复制mycoplasma DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved 16S-23S rRNA序列,由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同,因此可依所复制之DNA大小及其restriction fragment大小差异来作侦测与鉴定。

特点:灵敏(e.g. 0.1~1.6 CFU / 5 ul sample) 与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma (e.g. M. hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组,避免可能之污染。

缺点:PCR反应很灵敏,易有伪阳性结果。此方法尚在评估中,故结果仅作为参考和内部品管之一部份。

材料与设备:

ATCC mycoplasma detection kit:可作50~100 reactions.

提供1st stage primer mixture与2nd stage primer mixture

positive control DNA (A. laidlawii ; M. pirum)

PCR reagents :

Taq polymerase ( 5 U / ul )

dNTP( dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1.25 mM each )

10x PCR buffer (with 1.5mM MgCl2)

25mM MgCl2

sterile ddH2O

Machine / Equipment:

PCR thermal cycler

agarose电泳设备

DNA电泳胶体观察设备

无菌 PCR反应管

无菌1.5 ml微量离心管

无菌2ul, 20ul, 200ul, 1000ul Tips/ Pipetmans

方法: 此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

结果:使用UV light观察,并照相记录。

不过应用较多还是巢式PCR

方法:此PCR反应是一种nested PCR,包括2阶段PCR反应,1st stage PCR结束后,取其反应物作2nd stage PCR,然后取2nd PCR产物作agarose gel electrophoresis,依DNA band之有无及片段大小来分析结果。

结果:使用UV light观察,并照相记录。

方法再详尽点:st stage PCR reaction(total volume 25 ul):

测试样品 ( 2 ul / each )

直接取样测试细胞之培养液。

Positive control : mycoplasma DNA ( A. laidlawii ; M. pirum )

Negative control : ddH2O

Reaction mixture ( 23 ul / each )

10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

1st stage primer mixture 0.5 ul

dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 l

MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

Taq DNA polymerase ( 5 U/ul ) 0.1 ul

ddH2O 18.4 ul

PCR program ( 1st PCR与2 nd PCR相同):使用PCR thermal cycler

step 1 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

step 2 : denaturation: 94 ℃ 30 sec

step 3 : annealing: 55 ℃ 2 min

step 4 : extension: 72 ℃ 2 min

重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30 cycles

step 5 : final extension 72 ℃ 5 min

2 nd stage PCR reaction(total volume 25 ul)

测试样品:1st stage PCR product(1 ul / each)。

Reaction mixture ( 24 ul / each )

10x PCR buffer (含1.5 mM MgCl2 ) 2.5 ul

nd stage primer mixture 0.5 ul

dNTP ( 1.25 mM each ) 1.0 ul

MgCl2 ( 25 mM ) 0.5 ul

Taq DNA polymerase ( 5U/ul ) 0.1 ul

ddH2O 19.4 ul

PCR program同3.1.3;使用PCR thermal cycler

胶片电泳分析

胶片 (2.0%) 置备: 将2 g agarose溶于100 ml ( 1x ) TAE buffer。

电泳液:(1x) TAE buffer(Tris-acetate/EDTA electropheresis buffer)

选择100~500 bp DNA size Marker:取100 bp ladder Marker 5 ul ( 25 ng/ul )

取10 ul 2 nd stage PCR产物分析,各加入2 ul ( 6x ) loading dye。

进行电泳分离100V, 25 min。

胶片染色:ethidium bromide染色10 min,H2O退染10mim。(EtBr为致癌物质,请戴手套并小心操作)

结果:使用UV light观察,并照相记录。

Figure Agarose gel electrophoresis of the 2nd -stage PCR Products from eight commonly encountered Mycoplasma and A. laidlawii Species. ( from ATCC mycoplasma detection kit)

所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。如若转载请联系原作者。
  • 2019/12/12
    日前,国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)官网显示,礼来的CDK4/6抑制剂Abemaciclib(Verzenio)和安进的双特异性抗体注射用倍林妥莫双抗(blinatumomab,商品名:Blincyto)拟被纳入优先审评审批品种。
  • 2019/12/12
    生物探索有幸在礼来·学到临床研究人才培养项目一周年庆典上采访到了礼来中国高级副总裁,药物发展和医学事务中心负责人王莉博士、复旦大学附属儿科医院内分泌遗传代谢科主任医师罗飞宏教授和复旦大学附属华山医院药物临床试验机构办公室曹国英主任。
  • 2019/12/12
    新药研发是一个漫长且艰辛的过程,日本作为全球第二大创新药研发国家,仅次于美国,在1996年至2019年11月,累计批准新药406个。10年内仅在日本上市的新药也被日本公司所包揽。
查看更多
发表评论 我在frontend\modules\comment\widgets\views\文件夹下面 test