RNA的提取
【实验原理】 Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整

【实验原理】

Trizol 试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA 的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA 可以通过异丙醇沉淀获得。

【实验仪器】

1. 匀浆机

2. 低温离心机

3. 涡旋器

【试剂及配制】

1. Trizol

2. 三氯甲烷

3. 异丙醇

4. DEPC

5. DEPC 处理水

DEPC 溶解于ddH2O 中使其终浓度位0.1%,37℃处理12 h 或室温过夜,15 磅湿热消毒15 min。

6. 75%乙醇(0.1% DEPC 水配制)

【实验步骤】

1. 标本处理

1) 组织:50-200 mg 组织/ml Trizol,匀浆,室温放置5 min;

2) 细胞:1 瓶细胞(25cm2)/ml Trizol,缓慢摇动,室温放置5 min,反复吹吸几次收集,此时可保存于-70℃。

2. 去蛋白,去DNA

1) 加入0.2 ml 三氯甲烷,用力振摇15 sec;

2) 室温放置2-3 min;

3) 4℃,12,000 rpm 离心15 min;

4) 转移上层水相(约0.6 ml)至1.5 ml 离心管中。

3. RNA 沉淀

1) 加入0.5 ml 异丙醇,混匀;

2) 室温放置10 min;

3) 4℃,12,000 rpm 离心10 min;

4) 弃上清,沉淀以1 ml 75%乙醇洗涤;

5) 4℃,10,000 rpm,离心10 min;

6) 沉淀于室温晾干(约5-10 min)。

4. 溶解RNA

15

1) 以10~50 μl 0.1% DEPC 水溶解,若不马上使用,以1/10 体积3MNaAc (pH 5.0),2.5 倍体积无水乙醇沉淀,于-70℃贮存;

2) 定量:取1-3 μl 稀释至800 μl,测定OD260 及OD280。

D260/OD280=1.8~2.0

1 OD260= 40 μg/ml RNA

【注意事项】

1. 试剂均由0.1% DEPC 水配制。

2. 提取过程中所有材料(tube,tip)均为RNase free。

3. 操作过程中勤换手套,避免RNase 污染。

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