DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤
易生物实验 · 2010/03/12
一、实验目的 琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持

一、实验目的

琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法,具有操作方便、经济快速等优点。本实验学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术,掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理

琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法,这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物,利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应,达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电,在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应,即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品,其中有三种构型的分子:共价闭合环状的超螺旋分子(cccDNA)、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA>IDNA>ocDNA

核酸分子是两性解离分子,pH3.5是碱基上的氨基解离,而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离,所以分子带正电,在电场中向负极泳动;而 pH8.0-8.3时,碱基几乎不解离,而磷酸基团解离,所以核酸分子带负电,在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同,因此对泳动速度影响不大。在中性或碱性时,单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是:

1、样品的物理性状

即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。一般而言,电荷密度愈大,泳动率越大。但是不同核酸分子的电荷密度大致相同,所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说,分子量的常用对数与泳动率成反比,用此标准样品电泳并测定其泳动率,然后进行DNA分子长度(bp)的负对数­——泳动距离作标准曲线图,可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大,比如质粒分子,泳动率的大小顺序为:cDNA>IDNA>ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响,会出现相反的情况。

2、支持物介质

核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质,琼脂糖是一种聚合链线性分子。含有不同浓度的琼脂糖的凝胶构成的分子筛的网孔大小不同,是于分离不同浓度范围的核酸分子。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺(Acr)在N,N,N′-四甲基乙四胺(TEMED)和过硫酸铵(AP)的催化下聚合形成长链,并通过交联剂N,N′-亚甲双丙烯酰胺(Bis)交叉连接而成,其网孔的大小由Acr与Bis的相对比例决定。

琼脂糖凝胶适合分离长度100至60的分子,而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段(5bp-500bp)的分离效果最好。选择不同浓度的凝胶,可以分离不同大小范围的DNA分子。

3、电场强度

电场强度愈大,带点颗粒的泳动越快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小,所以电泳时一般采用低电压,不超过4V/cm。而对于大片段电泳,甚至用0.5-1.0V/cm电泳过夜。进行高压电泳时,只能使用聚丙烯酰胺凝胶。

4、缓冲液离子强度

核酸电泳常采用TAE、 TBE、TPE三种缓冲系统,但它们各有利弊。TAE价格低廉,但缓冲能力低,必须进行两极缓冲液的循环。TPE在进行DNA回收时,会使DNA污染磷酸盐,影响后续反应。所以多采用TBE缓冲液。

在缓冲液中加入EDTA,可以鳌合二价离子,抑制DNase,保护DNA。

缓冲液pH常偏碱性或中性,此时核酸分子带负电,向正极移动。

核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭(ethidium bromide EB)。溴化乙锭是一种扁平分子,可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物时,出现不同的效应。254nm的紫外线照射时,灵敏度最高,但对DNA损伤严重;360nm紫外线照射时,虽然灵敏度较低,但对DNA损伤小,所以适合对DNA样品的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高,且对DNA损伤不是很大,所以也比较适用。

使用溴化乙锭对DNA 样品进行染色,可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB。EB掺入DNA分子中,可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况,但是如果要测定核酸分子大小时,不宜使用以上方法,而是应该在电泳结束后,把凝胶浸泡在含0.5μg/mlEB的溶液中10~30min进行染色。BE见光分解,应在避光条件下4℃保存。

三、材料、试剂及器具

1、材料

ΛDNA/HindⅢ Marker(分子量标准);实验37的质粒提取物;实验39的酶切产物;实验40的连接产物。

2、试剂

加样缓冲液(6x):0.25% 溴酚兰,40%蔗糖;琼脂糖;溴化乙锭(EB);酶液(10mg/ml)。

3、器具

(1)电泳系统:电泳仪、水平电泳槽、制胶板等。

(2)紫外透射仪。

易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

四、操作步骤

1、按所分离的DNA分子的大小范围,称取适量的琼脂糖粉末,放到一锥形瓶中,加入适量的0.5×TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化,溶液透明。稍摇匀,得胶液。冷却至60℃左右,在胶液内加入适量的溴化乙锭至浓度为0.5μg/ml。

2、取有机玻璃制胶板槽,有透明胶带沿胶槽四周封严,并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。

3、水平放置胶槽,在一端插好梳子,在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液,使之形成均匀水平的胶面。

4、.待胶凝固后,小心拔起梳子,撕下透明胶带,使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。

5、在槽内加入0.5×TBE 电泳缓冲液,至液面覆盖过胶面

6、把待检测的样品,按以下量在洁净载玻片上小心混匀,用移液枪加至凝胶的加样孔中。

1μl加样缓冲液(6×)+5μl待测DNA样品

〔+0.5μlEB 液(10mg/ml)(注:若胶内未加EB,可选用此法)。〕

7、接通电泳仪和电泳槽,并接通电源,调节稳压输出,电压最高不超过5V/cm,开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

8、观察溴酚兰的带(蓝色)的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处,可停止电泳。

9、染色:把胶槽取出,小心滑出胶块,水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上,放进EB溶液中进行染色,完全浸泡约30min。

10、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜,赶去气泡平铺,然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门,打开紫外灯(360nm或254nm),通过观察孔进行观察。

五、注意事项

1、电泳中使用的溴化乙锭(EB)为中度毒性、强致癌性物质,务必小心,勿沾染于衣物、皮肤、眼睛、口鼻等。所有操作均只能在专门的电泳区域操作,戴一次性手套,并及时更换。

2、预先加入EB时可能使 DNA的泳动速度下降15%左右,而且对不同构型的DNA的影响程度不同。所以为取得较真实的电泳结果可以在电泳结束后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色。若胶内或样品内已加EB,染色步骤可省略;若凝胶放置一段时间后才观察,即使原来胶内或样品已加EB,也建议增加此步。

3、加样进胶时不要形成气泡,需在凝胶液未凝固之前及时清除,否则,需重新制胶。

4、以0.5×TBE作为电泳缓冲液时,溴酚兰在0.5%~1.4%的琼脂糖凝胶中的泳动速度大约相当于300bp的线性DNA的泳动速度,而二甲苯青 FF的泳动速度相当于4Kb的双链线形DNA的泳动速度。

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