总DNA质量检测及酶切
易生物实验 · 2010/03/20
实验目的: 了解掌握检测 DNA 质量的方法以及 DNA 定量的方法;了解影响 DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素;训练 DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作及 DNA 的限制性内切酶操作。 实验原理: 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近

实验目的:

了解掌握检测 DNA 质量的方法以及 DNA 定量的方法;了解影响 DNA 在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素;训练 DNA 的琼脂糖凝胶电泳操作及 DNA 的限制性内切酶操作。

实验原理:

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用,它们是重组DNA 的基础。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至8 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列

实验材料及试剂:

转基因烟草总 DNA ,琼脂糖,限制性内切酶 Dra I , EcoRI ,EcoRV , HindIII

实验步骤:

1.取 10μl DNA 于 0.8% 凝胶检测;

2.将 DNA 调节浓度至 300-400 ng/μl;

3.仔细阅读将所用的任何一种酶产品说明书,熟悉反应条件及酶切的贮存浓度( 10U-50U/μl )厂家配套试剂;

4.计算据反应条件所需要的各种试剂准确用量:( 0.5 ml tube 中)

DNA(3-5μg) 10μl

10 × buffer reaction 1.5μl

Enzyme (15 U/μl) 0.8μl (冰上)

ddH2O 2.7μl

混匀,短暂离心;

5.37 ℃ 温浴 1-2 hrs ( 纯 DNA) 或 10 hrs (粗制 DNA );

6.加入上样缓冲液终止酶切反应,也可 65 ℃加热 10 min 使酶变性失活;

7.电泳检测酶切效率:

每个样品取 1/10 量用琼脂糖电泳检测,制胶及点样方法同上。

结果分析:

若水稻 DNA 呈现均匀连续分布的一片,则酶切效果好,否则需重做;

DNA 被切烂: DNA 降解,重新提 DNA ;

DNA 切不动:杂质多(多糖,蛋白质,酚类,有机溶剂等),重新纯化;

若是 BAC 克隆 DNA ,酶切后应出现多条很清晰的不同大小 DNA 带。

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