大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验原理和步骤
易生物实验 · 2010/03/06
[实验原理] (供参考,试剂盒的Solution SS成分未知) 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是:在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟

[实验原理] (供参考,试剂盒的Solution SS成分未知)

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是:在0℃下的CaCl2低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物,此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理(热休克),可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上,37℃培养过夜,这样即可得到转化菌落。

[仪器、材料与试剂]

(一)仪器

1.小型高速离心机

2.恒温摇床

3.恒温箱

4.-20℃冰箱

5.恒温水浴器

(二)材料

1.氨苄青霉素

2.大肠杆菌DH5a

3.pUC19

4.1.5mL 离心管

5.枪头、枪

6.试管、培养皿

(三)试剂

1.快速感受态细菌制备试剂盒(申能博彩公司产品)

2.LB培养液

在950mL去离子水中加入:

胰蛋白胨 (tryptone) 10g

酵母提取物 (yeast extract) 5g

NaCl 10g

摇动容器直至溶质完全溶解,用Na0H调节pH至7.0,加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。

3.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成100mg/mL 溶液,置-20℃冰箱保存。

[实验步骤]

1.从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。

2.取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中,37℃振荡培养2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。

3.用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中,冰上放置3分钟后,加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意:1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻,防止细胞进入枪内。

4.将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中,每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。

5.将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。注意:在转移过程中要防止温度升高,解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块,将细胞迅速转移到塑料里,将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化:

1.新鲜制备的或-20℃下保存的100mL感受态细胞,置于冰上,完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2.加入5mL pUC19质粒,DNA浓度为10pg/mL,轻轻混匀。

3.冰上放置30分钟。

4.42℃水浴热激60秒。

5.冰上放置2分钟。

6.加400mL LB培养液,37℃ 250转/分振荡培养30分钟。

7.室温下4000rpm离心5分钟,用枪头吸掉400mL 上清液,用剩余的培养液将细胞悬浮。

8.将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。

9.平皿在37℃下正向放置1小时,待接种的液体吸收进琼脂后,将平皿倒置,培养过夜。

[实验结果]

经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数,计算制备的感受态菌的转化效率,以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。

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