细菌总DNA(total DNA, genomic DNA)提取和凝胶电泳检测
易生物实验 · 2010/03/09
基本概念: 总DNA(total DNA, genomic DNA)凝胶电泳 [实验目的] 1.学习细菌总DNA提取的原理和方法 2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法 [实验材料] 1.菌种 自己分离纯化后的细菌菌株 2.试剂 TE、溶菌酶溶液(20mg/ml)、10%

基本概念:

总DNA(total DNA, genomic DNA)凝胶电泳

[实验目的]

1.学习细菌总DNA提取的原理和方法

2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法

[实验材料]

1.菌种

自己分离纯化后的细菌菌株

2.试剂

TE、溶菌酶溶液(20mg/ml)、10% SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、5mol/L NaCl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇

3. 仪器

高速台式离心机、紫外检测仪

4. 其他材料:离心管、无菌吸头、移液器等

[实验步骤和过程]

(一)细菌总DNAD 提取

革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)

1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清

2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶(20mg/ml)溶液,40°C保温30分钟

3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K (20mg/ml),混匀, 37℃保温30分钟

4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀

5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管

6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟,5000转离心10分钟,转移上清到干净管中。

7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,离心沉淀DNA

8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存

革兰氏阴性菌总DNA提取方法

方法一:

1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液(0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶,pH=8).

2. 37℃温浴2h,

3. 加入1.5ml 10%SDS(0.1mol/l Nacl,0.5mol/l Tris,10%SDS,pH=8)反复颠倒混匀10min,10000r/min离心10min,取上清

4. 用等体积苯酚:氯仿:异戊醇各抽提1次,水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇,-20℃沉淀DNA1h,12000r/min 离心10min

5. 收集DNA沉淀,用100μl TE溶解

方法二:

1. 加入DNA提取液100 mmol/l,(Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/lNacl,1%pvp , 2%SDS,pH=8)旋涡混匀

2. 在摇床上250 r/min振荡2h,4℃沉淀DNA 1 h,13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀

3. 用100μlTE溶解DNA

方法三:

1.加入DNA提取液(100 mmol/l,Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/l磷酸钠,1.5mol/l Nacl,1%CTAB,pH=8),20μl蛋白酶K(20mg/ml)和500μl溶菌酶(0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶,pH=8),37℃温浴2h。

2.加入1 ml 20%SDS,65℃水浴过夜

3.加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡,12000 r/min 离心10min

4.取上清,用等体积苯酚:氯仿:异戊醇各抽提1次,水相中加入等体积TE,再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h

5.12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀,用200μlTE溶解

基本概念:

总DNA(total DNA, genomic DNA)凝胶电泳

[实验目的]

1.学习细菌总DNA提取的原理和方法

2. 学习琼脂糖凝胶电泳方法

[实验材料]

1.菌种

自己分离纯化后的细菌菌株

2.试剂

TE、溶菌酶溶液(20mg/ml)、10% SDS、蛋白酶K(20mg/ml)、5mol/L NaCl酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)、乙醇

3. 仪器

高速台式离心机、紫外检测仪

4. 其他材料:离心管、无菌吸头、移液器等

[实验步骤和过程]

(一)细菌总DNAD 提取

革兰氏阳性菌DNA提取方法(提取基因组DNA)

1. 3-6ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 弃上清

2. 加0.5ml TE悬浮沉淀,并加75μl 溶菌酶(20mg/ml)溶液,40°C保温30分钟

3. 加50μl, 10% SDS, 5μl 蛋白酶K (20mg/ml),混匀, 37℃保温30分钟

4. 加0.75ml, 5mol/L NaCl, 混匀

5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管

6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 静置10分钟,5000转离心10分钟,转移上清到干净管中。

7. 加2倍体积乙醇沉淀DNA, 颠倒混合, 室温下静止10分钟,离心沉淀DNA

8. 70%乙醇漂洗DNA后, 吸干, 用30-50μl TE溶解DNA, -20℃保存

革兰氏阴性菌总DNA提取方法

方法一:

1. 将菌液悬于1.5ml溶菌酶溶液(0.15mol/l Nacl, 0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶,pH=8).

2. 37℃温浴2h,

3. 加入1.5ml 10%SDS(0.1mol/l Nacl,0.5mol/l Tris,10%SDS,pH=8)反复颠倒混匀10min,10000r/min离心10min,取上清

4. 用等体积苯酚:氯仿:异戊醇各抽提1次,水相中加入40μl的3mol/l乙酸铵和3ml无水乙醇,-20℃沉淀DNA1h,12000r/min 离心10min

5. 收集DNA沉淀,用100μl TE溶解

方法二:

1. 加入DNA提取液100 mmol/l,(Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/lNacl,1%pvp , 2%SDS,pH=8)旋涡混匀

2. 在摇床上250 r/min振荡2h,4℃沉淀DNA 1 h,13000 r/min离心10min收集DNA 沉淀

3. 用100μlTE溶解DNA

方法三:

1.加入DNA提取液(100 mmol/l,Tris100 mmol/lEDTA,100 mmol/l磷酸钠,1.5mol/l Nacl,1%CTAB,pH=8),20μl蛋白酶K(20mg/ml)和500μl溶菌酶(0.15mol/l Nacl,0.1mol/l Na2EDTA, 15mg/ml溶菌酶,pH=8),37℃温浴2h。

2.加入1 ml 20%SDS,65℃水浴过夜

3.加入1/3倍体积饱和Nacl,剧烈振荡,12000 r/min 离心10min

4.取上清,用等体积苯酚:氯仿:异戊醇各抽提1次,水相中加入等体积TE,再加入0.6倍体积的异丙醇室温沉淀DNA 2h

5.12000 r/min 离心10min收集DNA沉淀,用200μlTE溶解

方法四:

1. 取20μl TE、20μl 饱和酚与无菌小离心管中

2. 取已经培养好的菌一环到上述离心管中

3. 震荡离心管30秒

4. 离心,8000rpm, 10min

5. 取上清3-5 μl 进行琼脂糖凝胶电泳检测

(二)DNA的琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA分子分离

把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测

溴化乙锭(EB)在紫外光照射下发射荧光,EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物

[实验材料]

细菌总DNA溶液

电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等

琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,溴化乙锭(EB),6X载样缓冲液

[实验步骤]

1.1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中,摇匀,微波炉加热溶解。

2.将冷却至50℃的凝胶倒入制胶室,插入梳子,室温冷却凝固

3.将凝胶置入电泳槽中,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,小心垂直向上拔出梳子

4.用移液器吸取总DNA 4μl于封口膜上,再加入1μl 的6X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔

5.打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约30min-60min

6.电泳结束后取出凝胶,置EB 溶液中染色5~10min,清水漂洗

7.将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光的DNA条带

制胶

加样

细菌总DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带,前端有大量RNA分子

 

 

[注意事项]

1.EB是致癌物质,切勿用手接触,更不要污染环境。

2.总DNA提取过程中,离心管不可剧烈震动,防止过多的断裂。

附:背景资料

琼脂糖电泳的优点

(1)琼脂糖含液体量大,可达98-99%,近似自由电泳,但是样品的扩散度比自由电泳小。

(2)电泳速度快。

(3)透明而不吸收紫外线,可以直接用紫外检测仪作定量测定。

(4)样品易回收,常用于制备。

4℃保存备用

常用的6X载样缓冲液

Ⅰ0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,40%蔗糖水溶液

Ⅱ0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,30%甘油水溶液

 

 

查看更多
发表评论 我在frontend\modules\comment\widgets\views\文件夹下面 test