回收酶切产物操作步骤
易生物实验 · 2010/03/10
1、将已经电泳确定的可回收的酶切产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶进行电泳。最好换用新的电泳缓冲液10 × TAE(10 ×Tris-乙酸)。 2、当溴酚蓝迁移至足够距离时(至少2 cm以上),在长波紫外灯下观察,用清洗过的刀片在目的片段前切下与目的片段同长,宽度适当(一般2 c

1、将已经电泳确定的可回收的酶切产物在合适浓度的回收用琼脂糖凝胶进行电泳。最好换用新的电泳缓冲液10 × TAE(10 ×Tris-乙酸)。

2、当溴酚蓝迁移至足够距离时(至少2 cm以上),在长波紫外灯下观察,用清洗过的刀片在目的片段前切下与目的片段同长,宽度适当(一般2 cm左右)的胶块。

注意:

①不要忘记在胶下垫一个新的塑料手套防止污染。

②小心不要将回收胶切裂,同时注意与目的带相邻的切面要尽量平整。

3、将切好的回收胶块放在回收胶槽内,在切去胶块处加入低熔点琼脂糖胶,待其凝固后将其小心放回电泳槽继续进行电泳。小心低熔点琼脂糖凝胶块与原回收胶块的交界面易断裂。

4、待目的带完全进入低熔点琼脂糖胶后,在长波紫外灯下用清洗过的刀片切下含有所需DNA 带的凝胶条,置于新的灭菌的1.5 mL Eppendorf管中,加300 μl TE。

5、65℃水浴10 min或更长使胶块完全融化。

6、立即加入等体积(300~350 μl)Tris-Cl饱和酚(pH 8.0),摇晃混匀。

7、12000 rpm离心5 min。

8、小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中,加入2.5~3倍体积(780 μl即可)预冷无水乙醇。注意不要吸入下层杂质及酚相,没把握时宁可放弃一些上层水相。

9、12000 rpm离心5 min。

10、小心将水相移到另一1.5 mL Eppendorf管中,加入2.5~3倍体积(780 μl即可)预冷无水乙醇。注意不要吸入下层杂质及酚相,没把握时宁可放弃一些上层水相

11、置液氮3 min,取出后可置于-20℃放几min。小心防止管子爆裂。

12、12000 rpm离心10 min。

13、迅速弃上清,一般在管底会有针尖大小的沉淀物,小心用无水乙醇清洗后置于恒温器上干燥(55℃)5~10 min至无乙醇气味,再加入20 μl ddH2O溶解。

14、取20 μl电泳定量后-20℃储存备用。

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