目的DNA片段的回收及纯化
易生物实验 · 2010/03/19
【实验目的】 掌握从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA 片段的方法。 【实验原理】 在NaI 存在的条件下,融化含有DNA 片段的凝胶块,使DNA 片段吸附于硅胶树脂上,最后用TE 缓冲液溶出DNA。 【实验仪器】 1.台式高速离心机 2.水浴锅 3.电泳仪及水平电泳槽

【实验目的】

掌握从琼脂糖凝胶中回收纯化目的DNA 片段的方法。

【实验原理】

在NaI 存在的条件下,融化含有DNA 片段的凝胶块,使DNA 片段吸附于硅胶树脂上,最后用TE 缓冲液溶出DNA。

【实验仪器】

1.台式高速离心机

2.水浴锅

3.电泳仪及水平电泳槽

【试剂及配制】

1. PCR Fragment Recovery Kit(硅胶树脂、NaI 溶液、浓缩缓冲液(使用时与100%乙醇等体积混合,此混合液称为洗净用缓冲液))

2. TE 缓冲液

【实验步骤】

1. 琼脂糖凝胶电泳制作1%琼脂糖凝胶,对目的DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。

2. 切胶

在紫外灯下切出含有目的DNA 片段的琼脂糖凝胶。

3. 将切下的含有DNA 条带的胶块,置于1.5 ml Eppendorf 管中。

4. 加入600μl NaI 溶液,55℃温浴10 min。

5. 加入20 μl 硅胶树脂,混匀后室温静置20 min。

6. 10000 rpm 离心1 min,弃上清。

7. 加入500 μl 洗净用缓冲液,振荡混匀后10000 rpm 离心1 min,弃掉上清。此过程重复一次。

8. 加入30 μl TE 缓冲液,55℃温浴5 min。

9. 10000 rpm 离心1 min,回收上清-20℃保存备用。

【注意事项】

1. 切胶时不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下,以防止DNA 损伤;同时应防止外源DNA 的污染。

2. 尽量除去不含目的DNA 的多余胶块,可以提高回收效率。

3. 硅胶树脂使用前要混匀。

4. 在步骤6 中,先保留上清,待回收过程结束后若经过检测回收效率高后可把上清弃掉,否则应保留上清,并再次加入硅胶树脂重新回收。

5. 长链DNA 的回收效率较高,短链DNA(500bp 以下)的回收效率稍有降低。

6. 洗脱DNA 时,TE 缓冲液或超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。

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