人外周血白细胞DNA制备
易生物实验 · 2010/03/21
一、原理 从全血制备白细胞DNA,可用非离子去污剂Triton X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜,释出血红蛋白及细胞核,在反应体系中含一定浓度蔗糖,维护核膜内外的渗透压,以防止核膜破裂,通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。向核悬液中加入SDS破坏核膜,并使DNA从

一、原理

从全血制备白细胞DNA,可用非离子去污剂Triton X-100直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜,释出血红蛋白及细胞核,在反应体系中含一定浓度蔗糖,维护核膜内外的渗透压,以防止核膜破裂,通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。向核悬液中加入SDS破坏核膜,并使DNA从核蛋白中解离,经蛋白酶K,酚/氯仿抽提等常规制备DNA程序,即可获得白细胞DNA。Triton X-100直接法,操作简便,经济,DNA得率高,可用于临床。

二、试剂和器材

试剂

1、溶液Ⅰ(pH7.6):0.32mol/L蔗糖;5mmol/L MgCl2;1%Triton X-100;0.01mol/L Tris-HCl (pH7.6)。

2、溶液Ⅱ:75mmol/L NaCl;24mmol/L EDTA Na2 (pH8.0)。

3、10%SDS

4、蛋白酶K:20mg/ml,-20℃贮存。

5、1×TE (pH8.0):10mmol/L Tris-HCl (pH8.0);1mmol/L EDTA- Na2 (pH8.0)。

6、0.9%NaCl

7、TE饱和重蒸酚(pH8.0)

8、氯仿/异戊醇混合液(24:1V/V)

9、10mol/L NH4AC

10、无水乙醇(AR),-20℃贮存。

11、70%乙醇,-20℃贮存。

以上试剂1、2、5、6、9均需高压灭菌,4℃贮存备用。

器材

高速冷冻机;恒温水浴;离心机;电泳仪及电泳槽。

三、操作

1、取2~5ml外周全血,加9倍体积的预冷溶液Ⅰ,振摇约5~10分钟至溶液均一透明,于 4℃3000×g离心10分钟。

2、弃上清液,沉淀加0.9%NaCl适量洗涤3000xg离心10分钟。

3、弃上清,加5ml预冷溶液Ⅱ悬浮核沉淀,加SDS至终浓度0.5%和加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml,混匀,65℃水浴保温5小时。

4、加1/2体积TE(pH8.0)饱和,混匀,旋转室温3分钟,再加1/2体积的氯仿/异戊醇,颠倒塑料管,轻轻充分混匀,于600×g室温离心3分钟,溶液分出两相,用大口塑料吸头吸取上层液于一洁净离心管中,反复抽提至界面清洁。

5、取上层液,再用等体积氯仿/异戊醇抽提1次,600×g室温离心3分钟。

6、取上层水相,加1/3体积的10mol/L NH4AC和2倍体积的预冷无水乙醇,充分混匀,纤维状DNA即从溶液中析出。

7、用大口塑料吸头吸出丝状沉淀物,用70%乙醇洗 涤1次,抽干,溶于适量1×TE(pH8.0)中,4℃贮存备用。

8、电泳鉴定(见质粒DNA的限制性酶及电泳分析)。

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