制备高效率感受态细胞的注意要点
易生物实验 · 2010/02/26
关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。 现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦。要想又

关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多,最复杂的莫过于电转化,而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言,高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。

现在大肠杆菌转化效率最高的要数电转化,可达到1010,但是操作起来比较麻烦。要想又简单,又能有较高的转化效率,最好的莫过于1990年《Gene》上刊登的由Inoue H.等提出的高效感受态的制备与转化方法。

根据实验室的实际情况,我们将其稍作修改,做成了GLP文件,但其中仍有许多可改进或需要注意的地方,其中有一些对普通感受态效率的提高也有一定的帮助。

1、所用器具的洁净程度。这一点非常重要,是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的,毋庸置疑。

2、培养基的装量。培养基的装量是很重要的,这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题,是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值:培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。

3、培养基的pH值。这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值,而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说,接种前的pH值在 6.8-7.2。等菌摇好后,可以测一下pH值,不要低于6.0,最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好,按要求做,肯定效率不低。

4、培养后的OD值。其实这是一个非常重要的参数,只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于 0.6、0.8等等。同时,OD值大时菌体总量大,感受态绝对数量要大一点。因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。

5、培养基中的各种离子。经验证明,当培养基中存在一定量的Mg2+离子时,该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时,使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20-30分钟加入,会收到很好的效果。

6、培养温度。文献及经验告诉我们,较低的温度培养有利于感受态的形成,这样可以获得较高的感受态,但太低又不实用,因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法。

7、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好,它会使感受态的效率增加。

8、液氮速冻也会使感受态的效率提高,因此推荐用液氮速冻感受态,然后保存于超低温冰箱内。至于在液氮中保存12小时以后再转入超低温冰箱,这点未做实验,只是一种感觉,第一次这样做了,没问题,以后就照此办理而已。

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