质粒的转化及转化子的鉴定
易生物实验 · 2010/03/20
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。 实验目的: 掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。 实验材料: 外源片段与载体的连接产

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

实验目的: 掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。

实验材料: 外源片段与载体的连接产物,大肠杆菌感受态细胞。

实验原理:

(1)热激法:大肠杆菌在 0 ℃ CaCl2 低渗溶液中,细菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经 42 ℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收 DNA 复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

(2)电转化法:外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定,形成电穿孔,不仅有利于离子和水进入细菌细胞,也有利于 DNA 等大分子进入。同时 DNA 在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

热激法转化实验步骤:

1.制备选择性培养基平板:在融化的 250ml LA 培养基中加入 250μl Amp( 100mg/ml ), 250μl X-gal (20mg/ml) , 25μl IPTG (200mg/ml) ,混匀后倒入灭菌培养皿中;

2.取出 3 管制备好的感受态细胞,放在冰上融化;

3.每 100μl 感受态细胞加入约 20ng 质粒 DNA , 3 管分别加连接产物、标准超螺旋质粒 DNA (阳性对照)及不加入任何 DNA (阴性对照),用移液器轻轻吸打均匀,在冰上放置 30 分钟;

4.热击:将离心管放置 42 ℃水浴,热击 90 秒,注意:勿摇动离心管;

5.冰镇:快速将离心管转移至冰浴,放置 1 - 2 分钟;

6.复苏:每管加 400μl SOC 培养基,在 37 ℃ 摇床温和摇动温育 45 分钟,使细菌复苏;

7.涂皿:取适当体积均匀涂布于含有 IPTG 、 X-gal 、抗生素( Amp )的 LA平板;

8.培养:倒置培养皿,于 37 ℃ 培养 12 - 16 小时 即可观察到蓝白相间的菌落(其中白色菌落为含有外源插入片段的转化子,蓝色菌落是载体自连的转化子)

质粒电转化大肠杆菌感受态细胞操作步骤

1.制备选择性培养基平板:在融化的 250ml LA 培养基中加入 250μl Amp( 100mg/ml ), 250μl X-gal (20mg/ml) , 25μl IPTG (200mg/ml) ,混匀后倒入灭菌培养皿中;

2.取出制备好的感受态细胞,放在冰上融化;

3.每管感受态细胞加入 1μl 连接产物,用移液器轻轻吸打均匀,置冰上;

4.电转化仪选择 1800V 作为输出电压;

5.将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化杯中,立即按下按纽电击;

6.立即加 1ml SOC 培养基到转化杯中重悬细胞;

7.将细胞转入合适的培养管中37℃培养 1 小时;

8.吸取合适体积的菌液涂布已倒好的选择培养基平板;

9.37℃培养过夜,观察结果。

附注:

1.利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时,用转化细胞铺平板的密度要低( 90mm 平板上不得超过 105 个菌落),同时 37 ℃ 培养不应超过 20 小时,具氨苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中,迅速灭活菌落周围的抗生素,从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。

2.鉴定转化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有:

①α 互补;

②杂交筛选;

③插入失活(一些老质粒如 pBR322 等) ;

④小量提取质粒,并酶切或 PCR 检测

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