直接导入法将中间载体质粒导入根癌农杆菌
易生物实验 · 2010/03/29
一、原理 同大肠杆菌一样,根癌农杆菌细胞在对数生长的早中期,经一定浓度的CaCl2处理后也可进入感受态。通过低温处理和37℃热击可使中间载体质粒DNA容易进入到根癌农杆菌细胞中,并在其中复制与表达。已摄入外源质粒DNA的细胞可在含有适当抗生素的培养基上生长,而不含质粒细菌则不能

一、原理

同大肠杆菌一样,根癌农杆菌细胞在对数生长的早中期,经一定浓度的CaCl2处理后也可进入感受态。通过低温处理和37℃热击可使中间载体质粒DNA容易进入到根癌农杆菌细胞中,并在其中复制与表达。已摄入外源质粒DNA的细胞可在含有适当抗生素的培养基上生长,而不含质粒细菌则不能在上面生长,借此可分离出携带中间载体质粒的根癌农杆菌。

二、目的

进一步了解中间载体质粒的特性,掌握中间载体质粒直接转入根癌农杆菌的原理和方法。

三、材料、试剂和器具

1、受体菌:农杆菌LBA4404(Rifr)。

2、中间载体质粒DNA(pBI 121, Kanr)。

3、20mmol/L CaCl2。

4、YEB液体和固体培养基(含相应抗生素)。

5、液态氮。

6、分光光度计。

7、冰块。

四、操作步骤

(一)感受态细胞制备

1、挑取一个单菌落接种于5mlYEB液体培养基中,28℃振荡(250rpm)培养过夜。

2、取2ml过夜培养物转入50ml YEB液体培养中,继续培养至OD600值约等于0.5。

3、将新鲜培养物转入50ml无菌离心管,冰浴中静置30分钟。

4、5000rpm离心5分钟,弃去上清液。

5、加入2ml预冷的20mmol/L CaCl2重悬菌体。

6、分装于无菌的Eppendorf管中,每管200ul,保存于4℃备用。

(二)转导

1、于一干净无菌的Eppendorf管中,加入20mg纯化的中间质粒DNA和200ml感受态细胞,混匀。

2、在冰上放置5分钟,转入液氮中冷冻8分钟,然后迅速转移到37℃水浴中温育5分钟。

3、加入800ul YEB液体培养基,28℃摇床上(250rpm)培养(预表达)4-5小时。

4、用微量加样器将转化的农杆菌移到含相应抗生素的YEB固体选择培养基平板上,用无菌玻棒涂布均匀。

5、室温下静置15分钟,然后倒置在28℃培养箱内,培养2-3天,直到长出单菌落。

查看更多
发表评论 我在frontend\modules\comment\widgets\views\文件夹下面 test