感受态菌的制备原理、仪器试剂和操作步骤
易生物 · 2010/04/06
1.目的 学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。 2.原理 细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的状态。 3.器材 旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式

1.目的

学会CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。

2.原理

细菌在0℃ CaCl2低渗溶液中胀成球形,丢失部分膜蛋白,成为容易吸收外源DNA的状态。

3.器材

旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,50ml 微量离心管,1.5ml 微量离心管,双面微量离心管架,台式冷冻离心机,制冰机,恒温摇床,分光光度计,超净工作台,恒温培养箱,摇菌试管,三角烧瓶,接种环。

易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html

4.试剂

E. coli XL1-Blue,LB培养基,0.1 mol/L CaCl2溶液,无菌ddH2O

5.实验准备

1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌);平板培养基,LB培养基(灭菌),冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液(灭菌),无菌ddH2O,摇菌试管(灭菌),三角烧瓶(灭菌)。

6.操作步骤

(1)取一支无菌的摇菌试管,在超净工作台中加入2ml LB(不含抗菌素!)培养基。

(2)从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种,放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中,然后接入含2ml LB培养基的试管中,37℃摇床培养过夜。

(3)取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧瓶中,37℃下250r/min摇床培养2~3h,测定OD600为0.375(&0.4~0.6,细胞数&108/ml,此为关键参数!)。以下操作除离心外,都在超净工作台中进行。

(4)将菌液分装到1.5ml预冷无菌的聚丙烯离心管中,于冰上放置10min,然后于4℃,5000rpm离心 10min。

(5)将离心管倒置以倒尽上清液,加入1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液,立即在涡旋混合器上混匀,插入冰中放置30min。

(6)4℃,5000rpm离心10min,弃上清液后,用1ml 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬,插入冰中放置30min。

(7)4℃,5000rpm离心10min,弃上清液后,用200μl 冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液垂悬,超净工作台中按每管100ml分装到1.5ml离心管中。可以直接用作转化实验,或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏(可存放数月)。

(8)在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇,擦干桌面

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