大肠杆菌感受态细胞的制备
易生物实验 · 2010/04/22
实验原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。 目前常用的感受态细胞制备方法有

实验原理感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生变化,成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2 法,简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。

一、材料

大肠杆菌 E.coli DH5α,100ml三角瓶,1.5ml 离心管(又称eppendorf管), 离心管架,1000 ul 、200ul枪头,大量冰块,

二、设备

微量移液器(200μl,1000μl),高压蒸汽消毒器(灭菌锅),恒温摇床、冷冻离心机, 超净工作台, 紫外光度计,双蒸水器,冰箱等。

三、试剂准备

1、LB液体培养基:称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g,NaCl 10 g,溶于800ml蒸馏水中,用NaOH调pH至7.5, 加水至总体积1升,高压下蒸气灭菌15分钟。

2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。

3、高压灭菌的0.1mo1/L CaCl2:母液1M CaCl2147 g CaCl2 2H2O,加水到1L

4、高压灭菌过的30%甘油

四操作步骤

大肠杆菌感受态细胞的制备

(1) (已预先准备好)从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落(超净工作台操作),接种于3~5ml LB液体培养中,37℃振荡培养12h左右,直至对数生长期。将该菌悬液以1:100~1:50转接于20ml LB液体培养基中,37℃振荡扩大培养,当培养液开始出现混浊后,每隔20~30min测一次OD600nm,至OD600nm≤0.5时停止培养;

(2) 取培养液1.5ml转入微量离心管中,在冰上冷却10min,于4℃,5000r/min离心10min(从这一步开始,所有操作均在冰上进行,速度尽量快而稳)。

(3) 倒净上清培养液,用1ml冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰浴,0~4℃,5000r/min离心10min;

(4) 弃去上清液,加入500µl冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞。0~4℃,5000r/min离心10min;

(5) 弃去上清液,加入100µl冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液,小心悬浮细胞,冰上放置片刻后,即制成了感受态细胞悬液;

(6) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验,也可加入占总体积15%左右高压灭菌过的甘油,混匀后在超净工作台分装到Eppendorf微量离心管中,液氮速冻后,置于-70℃条件下,可保存半年至一年。

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