细菌培养及CaCl2法制备感受态细胞
易生物实验 · 2010/04/29
实验目的: 明确培养基的配制原理;通过对LB培养基的配制,掌握配制培养基的一般方法和步骤;掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。 实验原理: 重组DNA分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中,通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 大肠杆菌与其它微生物一样,都具

实验目的:

明确培养基的配制原理;通过对LB培养基的配制,掌握配制培养基的一般方法和步骤;掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。

实验原理:

重组DNA分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中,通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

大肠杆菌与其它微生物一样,都具有稳定遗传性和变异性、遗传性,保证微生物本身特征的相对稳定,即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此。

菌种保藏的原理是:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以达最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处休眠状态,从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外,还不允许污染任何杂菌。此外,在保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。

常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)℃,由于在-70℃或液氮中冻存,细菌内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。在0~-70℃温度范围内,水晶呈针状,极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此,为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏,需要加保护剂。甘油可降低冰点,在缓慢的冻结条件下,能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细菌。甘油的使用浓度范围为15%-50%,一般常用30%。在保存瓶中按1:1加入60%的甘油和菌液,混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长,活力不受任何影响。

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质,用以培养或分离各种微生物。因此,营养基质应当有微生物所能利用的营养成分(包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素)和水。按培养基的物理状态分液体培养基和固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶,后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲,以琼脂最为合适,一般加入1.5~2.5%即可凝固成固体。此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。液体培养基是没有加琼脂,配好后成液体状态培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。

LB(Luria-Bertani)培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源,磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源,而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化,一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化,以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固,通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌,因此,要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性,以利于细菌的生长繁殖。

实验材料:

[1].大肠杆菌菌株:DH5α

[2].酵母提取物(Yeast extract)

[3].蛋白胨(Tryptone)

[4].NaCl

[5].琼脂 (agar)

[6].1M NaOH

[7].1M HCl

[8].0.1M CaCl2:在100ml纯水中溶解2.8gCaCl2.6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份,-20℃冻存。

[9].37℃培养箱、试管,三角烧瓶,烧杯,培养皿(9cm),量筒,玻棒,培养基分装器,天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,pH试纸(pH5.5~9.0),棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳等。

实验步骤:

1、LB培养基的准备

[1].称量:准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g,放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。

[2].溶化:加入800ml ddH2O,用磁力搅拌子搅拌溶解。

[3].调pH:先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用1M NaOH调节pH达7.0。反之,则用1M HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。pH调节好之后,用ddH2O定容到1000ml。如果要配制固体LB培养基,1000ml液体培养基加入15 g琼脂。

[4].分装:按实验要求,将液体培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面,分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。

[5].加塞:培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。

[6].包扎:加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

[7].灭菌:将上述培养基以0.1~0.165 MPa (120~130)℃高压蒸汽灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。

[8].搁置斜面:将灭菌的试管培养基冷至50℃左右,将试管棉塞端搁在玻棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

实验目的:

明确培养基的配制原理;通过对LB培养基的配制,掌握配制培养基的一般方法和步骤;掌握细菌的接种、培养的无菌操作方法和步骤。

实验原理:

重组DNA分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中,通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。

大肠杆菌与其它微生物一样,都具有稳定遗传性和变异性、遗传性,保证微生物本身特征的相对稳定,即无性繁殖过程中能够保持原有的性状,为菌种保藏提供了有利因此。

菌种保藏的原理是:通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段,以达最大限度地降低菌种的代谢强度,抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止,生命活动将处休眠状态,从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外,还不允许污染任何杂菌。此外,在保存前应确保菌种的单纯性,先分离单菌落后进行鉴定,然后再繁殖保存。

常用的长期保存法有:液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜(DMSD)等保护剂。目前比较常用的甘油低温保存法(-70~-196)℃,由于在-70℃或液氮中冻存,细菌内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。在0~-70℃温度范围内,水晶呈针状,极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此,为了避免0~-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏,需要加保护剂。甘油可降低冰点,在缓慢的冻结条件下,能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细菌。甘油的使用浓度范围为15%-50%,一般常用30%。在保存瓶中按1:1加入60%的甘油和菌液,混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长,活力不受任何影响。

培养基是人工地将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质,用以培养或分离各种微生物。因此,营养基质应当有微生物所能利用的营养成分(包括碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素)和水。按培养基的物理状态分液体培养基和固体培养基。固体培养基是在液体培养基中加入凝固剂即为固体培养基。实验用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶,后者用于配制自养微生物的固体培养基。对其他多数微生物来讲,以琼脂最为合适,一般加入1.5~2.5%即可凝固成固体。此培养基可供分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等用。液体培养基是没有加琼脂,配好后成液体状态培养基。常用于生理代谢的研究和工业发酵等。

LB(Luria-Bertani)培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,有时又称为普通培养基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源,磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源,而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化,一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化,以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固,通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌,因此,要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性,以利于细菌的生长繁殖。

实验材料:

[1].大肠杆菌菌株:DH5α

[2].酵母提取物(Yeast extract)

[3].蛋白胨(Tryptone)

[4].NaCl

[5].琼脂 (agar)

[6].1M NaOH

[7].1M HCl

[8].0.1M CaCl2:在100ml纯水中溶解2.8gCaCl2.6H2O,用0.22μm滤器过滤除菌,分装成10ml小份,-20℃冻存。

[9].37℃培养箱、试管,三角烧瓶,烧杯,培养皿(9cm),量筒,玻棒,培养基分装器,天平,牛角匙,高压蒸汽灭菌锅,pH试纸(pH5.5~9.0),棉花,牛皮纸,记号笔,麻绳等。

实验步骤:

1、LB培养基的准备

[1].称量:准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g,放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮,在称取时动作要迅速。

[2].溶化:加入800ml ddH2O,用磁力搅拌子搅拌溶解。

[3].调pH:先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值,如果pH偏酸,用1M NaOH调节pH达7.0。反之,则用1M HCl进行调节。注意pH值不要调过头,以避免回调,否则,将会影响培养基内各离子的浓度。pH调节好之后,用ddH2O定容到1000ml。如果要配制固体LB培养基,1000ml液体培养基加入15 g琼脂。

[4].分装:按实验要求,将液体培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上,以免沾污棉塞而引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装试管,其装量不超过管高的1/5,灭菌后制成斜面,分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝。

[5].加塞:培养基分装完毕后,在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染,并保证有良好的通气性能。

[6].包扎:加塞后,将全部试管用麻绳捆扎好,再在棉塞外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞,其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后,外包牛皮纸,用麻绳以活结形式扎好,使用时容易解开,同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

[7].灭菌:将上述培养基以0.1~0.165 MPa (120~130)℃高压蒸汽灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌,则应放入冰箱内暂存。

[8].搁置斜面:将灭菌的试管培养基冷至50℃左右,将试管棉塞端搁在玻棒上,搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

[9].制作平板培养基:将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,每皿约倒入10ml,以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15min左右,待培养基凝固后,再5个培养皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24h后检查,如培养基没有长杂菌,即可用来培养微生物。

[10].无菌检查:将灭菌的培养基放入37℃的细菌培养箱中培养24~48h,以检查灭菌是否彻底。

2、细菌的复苏

[1].复苏菌种前应准备适于该菌种生长的固体、液体培养基和培养设备,所有操作均应在符合生物安全保护及无菌条件下进行。

[2].启开菌种宜采用锯开法(锯开前用70%酒精棉消毒菌种管外壁)。用吸管将液体培养基0.3ml左右注入被启开的菌种安瓶中并吹打,使安瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。

[3].将上述菌悬液全部吸出,分别接种到固体斜面和液体培养管中,一般放置在37℃培养箱培养18~24h(具体接种方法见下面的实验介绍)。

[4].次日观察菌种的生长情况,如菌种未生长,应继续培养至72h。

[5].复苏后的菌种在传1~2代后使用。

[6].暂不启开的安瓶及复苏后需保藏的斜面应于4℃中保藏。

3、细菌的培养

[1].固体平板培养基培养

A.右手持接种环,经火焰灭菌,待凉后,挑取大肠杆菌保存液少许。

B.左手斜持琼脂平板,皿盖留在桌上,于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端,来回划线,涂成薄膜(约占平板总表面积的1/10),划线时接种环与平板表面成30~40º角,轻轻接触,以腕力在平板表面行轻快地滑移动作,接种环不应划破培养基表面。

C.烧灼接种环,杀灭环上残留细菌,待冷(是否冷却,可先在培养基边缘处试触,若琼脂溶化,表示未凉,稍等再试),从薄膜处取菌作连续平行划线,约占平板表面1/5左右,再次烧灼接种环,等三次平行划线;以同样方法作第四次,第五次划线,将平板表面划完。完毕,盖上平皿盖,底面向上,用标签或腊笔注明菌名检验号码,接种者班级,姓名,组别等,置37℃孵育培养24h后观察结果。

[2].液体培养基培养

无菌操作基本方法同前面的步骤。吸取10μl保存液,沿液体培养基的三角瓶瓶壁接近液体表面之管内壁轻轻将菌液加入液体培养基中(勿用力振荡),使细菌混入培养基内,塞好棉塞,用牛皮纸包扎好,置于37℃水浴摇床中200rpm培养,次日观察结果。

[3].斜面培养基接种法

A.左手持菌种管与培养基管,斜面皆向上,菌种管在外侧,右手如拿毛笔的姿势持接种环,将铂丝与欲进入试管的柄部通过火焰灭菌。

B.右手的小指与掌心夹下培养基管棉塞,第四指与小指夹下菌种管棉塞,管口通过火焰。

C.接种环伸入菌种管,沾取少许菌种。

D.接种环伸入培养基管,在斜面上蜿蜒划线。注意沾有菌种的接种环不可碰管口与其它地方。

E.管口再通过火焰,并将棉塞塞于原来的试管。

F.接种环再灭菌。

4、细菌的保种

[1].短期固体培养基保藏(斜面试管培养基保存法):

按照上面的方法划线接种于斜面试管培养基中,37℃过夜培养。将生长好的菌种用牛皮纸包好,置4℃冰箱中保存。定期进行传代培养、再存放。

[2].长期甘油冷冻保藏:

A.在液体培养基中生长的细菌培养物:取0.85ml细菌培养物,加入0.15ml高压灭菌甘油,振荡培养物使甘油分布均匀,然后转移到标记好的保存管内,密封,

在乙醇-干冰或液氮中冻结后再转至-70℃长期保存。在复苏时,用灭菌接种针刮取冻结的培养物表面,然后立即把黏附于接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面,于37℃过夜。

B.在琼脂平板上生长的细菌培养物:从琼脂平板表面刮下细菌放入装有2ml LB的无菌试管内,再加入等量的含有30%灭菌甘油的LB培养基,振荡使甘油完全分布均匀后,分装于无菌保存管内,密封,再按前述方法冰冻保存。这一方法的优点在于可用于保存在质粒载体上建立的cDNA文库。

5、感受态细菌的制备(CaCl2转化法)

[1].划线复壮宿主菌37℃过夜。挑一单菌落于30ml LB液体培养基中,37℃,200rpm摇至OD600=0.2~0.4,取出置于冰上10~15min。

[2].取1mL菌液于灭菌的1.5ml离心管中。4℃,5000rpm离心5min回收细胞。弃上清,吸干残存培养基,加500μl冰预冷的0.1M CaCl2,重悬菌体,置冰浴15~30min。

[3].4 ℃5000rpm离心5min回收细胞。弃上清,吸干水,加100μl冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体。放置于4℃用于转化,若不用则加30%甘油置-70℃备存。

注意事项:

[1].灭菌后的所有操作都应该在无菌的情况下进行。

[2].配制药品、培养基等均用超纯水。

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