四川大学魏于全院士发表CRISPR新研究
生物通/王英 · 2016/09/23
近期在国际学术期刊《Oncotarget》上发表的一项研究中,来自四川大学和南开大学等处的研究人员,采用CRISPR相关的蛋白9系统,揭示了ZNF32功能在神经干细胞标记SOX2表达和再生调控中发挥的一个关键作用。


人锌指蛋白32(ZNF32)是一种Cys2-His2锌指转录因子,在细胞命运中发挥重要的作用,但是其功能仍然是未知的。近期在国际学术期刊《Oncotarget》上发表的一项研究中,来自四川大学和南开大学等处的研究人员,采用CRISPR相关的蛋白9系统,揭示了ZNF32功能在神经干细胞标记SOX2表达和再生调控中发挥的一个关键作用。

本文通讯作者是四川大学生物治疗国家重点实验室的魏于全院士和林苹教授。魏于全院士是教育部“长江学者奖励计划” 第二批特聘教授,1997 年国家杰出青年科学基金获得者,要从事肿瘤生物治疗的基础研究、应用开发与临床医疗实践。相关研究结果已发表在Nature Medicine, PNAS, Blood, CancerRes., J. Immunol., J. Biol.Chem等国际期刊。2003年当选为中科院院士。林苹教授现任四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室实验肿瘤研究室主任,长期从事肿瘤和慢性炎症免疫性疾病发病机制的研究,在肿瘤微环境生物学和慢性炎症病理机制和调控研究中具有特色。

转录因子(TFs)在许多各种不同的人体生物学功能中发挥关键作用,并通过与它们靶基因启动子中的特定顺式调控序列结合,而调节基因的表达。TFs的DNA结合特异性,是基于调控过程中的一个关键组成部分。与遗传密码形成对照,转录调控码远未得到破译,是由TFs的序列特异性决定的。识别TFs结合的特定DNA序列,有助于调节基因表达的顺式调控模块(CRMs)的计算预测,并有助于TF功能的进一步理解。Cyclic Amplification and Selection of Targets (CASTing),可选择特定蛋白质结合的DNA序列,已被用来作为筛选TFs的DNA结合序列的一种快速而通用的体外方法。

Cys2-His2 (C2H2)锌指蛋白是公认的人类转录因子中最大的一类,它参与细胞增殖、分化、发育,甚至许多疾病(如癌症)相关的细胞过程。生物信息学数据库表明,ZNF32属于TF的Krüpple样家族,包含六个连续的典型的C2H2型锌指结构域和一个退化的C2H2锌指基序,并可能结合DNA用于转录调控。此前,该研究小组表明,Zfp637——人类ZNF32 小鼠同系物,可抑制成肌细胞分化,并保护细胞免受氧化应激性早衰。所有这些研究结果表明,ZNF32在细胞过程中扮演着一个重要但被忽视的作用。因此,本研究的重点是探讨ZNF32在侧线系统再生中的功能和机制。

再生是更新、恢复和生长的一个重要过程。从细菌到人类,每一个物种都是能够再生的。斑马鱼是探讨器官/组织发育、再生与人类疾病的一个重要模式生物。在其最基本的水平上,再生涉及到细胞增殖和分化过程中的基因调控的分子过程。干细胞对于有益的组织和器官再生有着巨大的希望。神经干细胞标志物SOX2是一个关键的转录因子,在发育过程中,在胚胎干细胞中表达,并在早期神经外胚层和神经祖细胞中广泛表达。SOX2水平是受到严格调控的,SOX2表达的失调可导致分化行为的显著变化。SOX2对于斑马鱼侧线系系统中的毛细胞发育是至关重要的,并且在除毛细胞以外的大量细胞中表达。这些结果表明,SOX2可能对于毛细胞再生的前体细胞维护,起着重要的作用。

此外,在所有真核细胞中,锌指蛋白在基因调控中的作用,需要它们从细胞质到细胞核的运输。一般情况下,离子和可溶性的小分子可以通过扩散被运送通过核膜,而来自细胞质的大多数核蛋白的运输是由核孔复合体介导的。运输是一个能量消耗的过程。此外,NLS突变体可导致蛋白的错误定位,从而导致TF功能破坏、细胞生理过程的变化和许多人类疾病,如肌萎缩性侧索硬化症和脆性X综合征。ZNF32是一个确认的核蛋白质,其功能是作为一个TF,在之前的研究中已经得以确认,然而,其特异性的靶DNA序列和NLS,尚未见报道。

在本研究中,研究人员测量了斑马鱼发育过程中斑马鱼ZNF32同源基因zfZNF32的表达谱。该研究小组使用CRISPR/Cas9系统,制备了ZfZNF-/-,并用其在侧线系统中研究毛细胞损伤和再生。研究人员确定了ZNF32的靶DNA序列和NLs。此外,该研究发现,通过ZNF32 的SOX2基因表达的转录调控,对于再生是至关重要的。这项研究揭示了SOX2调控的一个新的和重要的机制,并凸显了ZNF32再生的意义。

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  • Loss of ZNF32 augments the regeneration of nervous lateral line system through negative regulation of SOX2 transcription

    Human zinc finger protein 32 (ZNF32) is a Cys2-His2 zinc-finger transcription factor that plays an important role in cell fate, yet much of its function remains unknown. Here, we reveal that the zebrafish ZNF32 homologue zfZNF32 is expressed in the nervous system, particularly in the lateral line system. ZfZNF32 knock-out zebrafish (zfZNF-/-) were generated using the CRISPR-associated protein 9 system. We found that the regenerative capacity of the lateral line system was increased in zfZNF-/- upon hair cell damage compared with the wild type. Moreover, SOX2 was essential for the zfZNF32-dependent modulation of lateral line system regeneration. Mechanistic studies showed that ZNF32 suppressed SOX2 transcription by directly binding to a consensus sequence (5’-gcattt-3’) in the SOX2 promoter. In addition, ZNF32 localizes to the nucleus, and we have identified that amino acids 1-169 (Aa 1-169) and each of three independent nuclear localization signals (NLSs) in ZNF32 are indispensable for ZNF32 nuclear trafficking. Mutating the NLSs disrupted the inhibitory effect of ZNF32 in SOX2 expression, highlighting the critical role of the NLSs in ZNF32 function. Our findings reveal a pivotal role for ZNF32 function in SOX2 expression and regeneration regulation.

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