对于方舟子的质疑,韩春雨做出这样的回应
生物谷 · 2016/07/07
韩春雨团队和他们的NgAgo-gDNA技术自第一次被报道,就一直倍受关注,近日,方舟子公开发文质疑韩春雨"诺奖级"实验成果的可重复性问题,而对于方舟子和部分网友的质疑,韩春雨也于7月2日在百度贴吧上做出了回应。


韩春雨团队和他们的NgAgo-gDNA技术自第一次被报道,就一直倍受关注,近日,方舟子公开发文质疑韩春雨"诺奖级"实验成果的可重复性问题,而对于方舟子和部分网友的质疑,韩春雨也于7月2日在百度贴吧上做出了回应。

早前,韩春雨一经报道,就有细心的人在贴吧上找出了韩老师。(邮箱已暴露了身份)


而此次韩春雨老师的回复是其在"国际米兰吧"上的回帖。网友"第十三米的阳光"引用方舟子的文章《河北科技大学韩春雨"诺贝尔奖级"实验的重复性问题》中的内容在该贴吧内发帖。(http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93027569268)


韩春雨老师用自己的"槐北路"的账号进行了回复


对于方舟子和网友们提出的质疑,韩春雨在该回复里进行了详解解答:

质疑1.:图片3:有人能重复(FACS和Western Blot),但那有可能是假阳性。

韩春雨的回复:细胞做好检测,不要有寄生菌污染,不要有支原体污染(Ago系统对污染特别敏感---特别是单转guide假阳性---我非常确定在没有污染的情况下,单转guid不会影响GFP表达,假阴性也大多因为细胞污染,假阳性和假阴性我都遇到过,国内买的细胞我就不吐槽了),转染用的质粒质量要好(可用30ngGFP转细胞,若是均一且效率高表明质量好,强弱不均一则表明质量差,越不均一表明质量越差),guide磷酸化完全(没有磷酸化不能load和切割---谢谢印证我的Fig2结果,至于怎么检测,自己跑个PAGE看看---)

质疑2. 目前还未见有人反映重复出了图4结果。

韩春雨的回复:Fig4,也是几乎惟一算是有难度的,就是控制转染时的细胞密度和用血清控制细胞生长,时间稍长,毕竟NgAgo未经过系统的密码子优化---照着online method上protocol for genome editing and T7E1做(小经验,PCR最好不要有引物二聚体,如果引物二聚体多请重设引物;PCR产物直接回收最好不跑胶回收,可能跟ago切24bp有关,设好对照!)---银染分辨率高,可以排除T7E1假阳性,能做出预期条带后请用PCR产物去测序。欢迎大家广泛使用此系统,并分享成功经验和失败教训。附,addgen上的质粒,可以直接用作基因组编辑。再次强调,不加NgAgo,就能抑制GFP,是假阳性,是细胞出问题了(谢天谢地不但我自己而且审稿人也有这个对照)出现假阳性的细胞切基因组就没戏了。对于Fig4,若是不习惯做银染,也可以直接做KI:doner 用GFPcoden+polyA signal,前后加几个保护性的碱基---从GFP-N1扩出来连到T-vector上,再从此doner-Tvector上扩(防止GFP-N1污染的假阳性)出来纯化,500-800ng共转(for each well of 24 well plate)。

而对于韩春雨的回复,方舟子也做出了回应:


那么这种"高超的实验技术"究竟是不是实验细节的处理,不同网友也有自己的看法,有网友表示pcr已经有那么久的历史,且机器已经半自动化,但目前也不是每个人次次都能成功。在实验过程中,技术不难,难的是整个实验过程都不能有半点差错。韩春雨老师经过几年发表出来的结果,而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月。关键一步都没处理好,所以做不出来,但是恰恰是关键的一步 这也是他能做出来成果,别人做不出的原因。

韩春雨老师也强调了无污染的细胞重要性:


而对于目前大家较为关注的重复性问题,目前网上虽然有一些表示没有重复出来,一方面韩春雨老师经过几年发表出来的结果,而目前大部分实验室也只刚刚尝试几个月,另一方面一些网友认为目前重复不出来的原因也可能是在这个风口浪尖,为避免惹祸上身,重复出来的人也未必想站出来发声。而且也有网友爆料来自印度的学者Dr. Debojyoti Chakraborty发言已重复出韩春雨NgAgo实验。

Hi guys,

We have used this system and it works. We have followed the same protocol as mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the phenotype after 48 and 72 h.

cheers

debo

并且详细分享了他们的protocol:

Here's the protocol we followed:

We first phosphorylated the gDNA using the PNK kit from Ambion for 1 hr followed by heat inactivation at 95 degrees for 5 min. We then went on to transfect 100,000 cells in 12 well plates as follows:

Mix 1:

Lipo reagent- 3ul

Optimem- 43ul

EGFP N1- 1 ug

NgAgo- 900 ng

gDNA- 500 ng

Mix 2:

Lipo 3000- 2ul

Optimem- 48ul

Mix 3:

Media- 250ul

Optimem- 150ul

Mix1 and Mix2 was incubated for 10min each and then both were mixed together and incubated at RT for 30min

This was now added to cells. To each well, 50 ul of Mix 3 was added on top. No further media was added to the cells.

After 12h, the mix was removed and fresh media was added.

科研成果的权威性是在质疑声中建立起来的,而影响力越深远、意义越重大的成果,受到的质疑就越多。最前沿领域的科研成果的鉴别通常异常困难,难以证明,也难以证伪。而检验一项新技术需要时间和客观标准,实验肯定有关键细节,韩春雨本人也不回避系统的不稳定性,也表示希望与同行进行交流,且目前在努力改进,即将推出2.0版和smart版,让我们拭目以待吧。

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