【技术综述】循环DNA的分子大小也能作为诊断依据
2016/05/23
在Trends in Genetics近期在线发表的一篇综述探讨了用于血浆cfDNA谱的分析技术。该篇评论的重点是循环DNA的大小分布。这篇综述将讨论检测cfDNA大小特征的方法;探讨了cfDNA谱在不同临床情况:包括癌症、怀孕等潜在的诊断应用。


图1 循环cfDNA

在癌症病人的血浆中发现游离DNA,在孕妇的血浆中发现胎儿DNA,分别在分子诊断中带来了令人兴奋的机会。对于循环游离DNA(cfDNA)生物学特性的理解对于人们在不同的临床环境最佳使用这种分子是必不可少的。在Trendsin Genetics近期在线发表的一篇综述探讨了用于血浆cfDNA谱的分析技术。该篇评论的重点是循环DNA的大小分布。这篇综述将讨论检测cfDNA大小特征的方法;探讨了cfDNA谱在不同临床情况:包括癌症、怀孕等潜在的诊断应用:

妊娠妇女血浆中胎儿来源的分子短于母体分子。

来自肿瘤细胞DNA短于癌症患者血浆中非恶性细胞的。

不同种类的循环DNA大小之间的差异,可用于发展大小为基础的分子诊断,例如最近在无创产前测试和癌症测试的努力。

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决定cfDNA片段大小的方法

1)凝胶电泳 cfDNA电泳的条带如图2所示,可以看cfDNA大小谱系显示180bp核小体蛋白的整数(1~5×)倍数,不过电泳在区分和定量上有局限性。


图2 cfDNA凝胶电泳

2)qPCR 运用qPCR来检测cfDNA谱主要是通过运用跨越感兴趣的目标区域的不同大小的扩增片段来实施。如图3所示,不同扩增区定量读长的差异表示了相应不同大小的cfDNA的量,大片段相对于小片段的比例也可以转化成DNA完整性指数。这一原则已经应用在胎儿和母体和片段大小,已经比较肿瘤和肺肿瘤来源的cfDNA。这个方法只能用于已知的位点,而不能用于全基因组范围的分析。


图3 qPCR检测cfDNA谱

3)显微镜 显微镜电子显微镜和原子力显微镜可以用以观察DNA分子的构象,并测量分子长度。运用这个技术,cfDNA的长度由1bp等于0.34nm的假设折算。然而这个方法需要精密的工作,耗时且通量低。

4)大规模平行测序 大规模平行测序的技术出现使得数百万甚至上亿的cfDNA分子大小的检测成为可能,这个检测通常是使用如图4所示的配对末端测序实施的。和凝胶电泳及位点特异性PCR相比,大规模平行测序允许在基因组范围和在单个碱基水平对cfDNA进行精细分析。


图4 大规模平行测序检测cfDNA分子大小

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cfDNA的来源

如图2这样的大小谱系表明了凋亡是产生cfDNA的重要机制。研究显示了在血浆中的cfDNA在很多状况下产生,比如怀孕、癌症、肝/骨髓移植和系统性红斑狼疮,通常由DNA短片段组成。最近大规模平行测序的结果显示了血浆DNA显示了在166bp有显著的峰,另外有一系列每10bp间隔的143bp等更小的峰。这些发现表明了cfDNA分子是由凋亡的酶分解过程产生的,核小体相关的DNA包装在形成这样的酶切模式中起了重要作用。

1)源于怀孕的DNA分子

早期qPCR的结果显示母亲血浆中源于怀孕的DNA分子要比母亲的背景DNA短。胎儿和母体DNA最显著的差异是166bp的峰相对地减少和143bp等较小的峰相对地增加。通过母体和胎儿DNA之间大小的差异,已被证明血浆DNA大小的分析可用于检测胎儿染色体非整倍数,如图5。研究发现较小尺寸的cfDNA似乎与较低水平的DNA甲基化相关,这种现象可能在塑造cfDNA片段的大小中起了重要的作用。


图5 胎儿和母体来源cfDNA的差异 

2)肿瘤来源的DNA

运用qPCR分析发现在癌症患者中较长的DNA的比例较多,这种状况被发现在抗癌治疗后是可逆的,如果变化持续的话意味着较差的预后。相反的,用qPCR分析肿瘤相关的突变位点,结果显示从肿瘤细胞来源的cfDNA比从正常组织的要短。

这种从qPCR获得的看似不同的结果出现困惑和难以调和。在2015年,有一项研究试图调和这些明显矛盾的结果(见图6),用配对末端的大规模平行测序对延长和缩短的癌症患者血浆中的DNA进行分析。这比测定胎儿的基因大小分布更具有挑战性,因为肿瘤衍生的血浆DNA不是很容易区分与血浆中非肿瘤来源的背景。尽管癌症特异性突变的检测提供了一种基因型的方法来区分肿瘤与非肿瘤细胞DNA,但只有有限数量的癌症特异性突变存在。大规模平行测序的分析显示在肝癌患者血浆中循环DNA大小谱显示显著的166bp的峰,以及一系列10bp为周期渐减小的峰,和在怀孕妇女和器官移植的受体病人中类似。血浆中肿瘤DNA的量越大,低于150bp的短DNA片段比例越高。


图6 大规模平行测序对癌症患者血浆中的cfDNA进行分析

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应用前景

循环DNA在新一代的分子诊断有着应用前景,应用范围从癌症测试到无创产前检查。其中的一个成功例子是NIPT检测胎儿的cfDNA在全球的快速运用。而对胎儿染色体非整倍体检测第一代NIPT是基于分子计数的。在这篇综述中所描述的,对于血浆DNA的生物学的新认识将带来基于分子大小检测的新方法。

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