Cell子刊:潜藏的线粒体DNA突变,可能会破坏iPSC治疗价值
生物通 · 2016/04/18
4月14日,《Cell Stem Cell》一项研究指出,随着年龄的增长,人类线粒体DNA中会积累突变。这一发现,对于使用诱导多能干细胞治疗疾病有重要意义。如果iPS细胞来源于一位上了年纪的病人的细胞,那么可能就含有错误的线粒体DNA,这可能削弱“诱导多能性”细胞的治疗价值。


4月14日,《Cell Stem Cell》发表的一项研究指出,随着年龄的增长,人类线粒体DNA中会积累突变。这一发现,对于使用诱导多能干细胞(iPSC)的潜在疗法有重要意义,iPSC是从患者的皮肤细胞生成,并可用于修复受损组织或器官。如果“诱导多能性”细胞来源于一位上了年纪的病人的细胞,那么可能就含有错误的线粒体DNA,这可能削弱“诱导多能性”细胞的治疗价值。

因此,本文共同资深作者、美国俄勒冈健康与科学大学胚细胞和基因治疗中心主任Shoukhrat Mitalipov和辛辛那提儿童医院线粒体医学项目主任、医学遗传学家、华人教授黄涛生(Taosheng)表示,用于治疗用途的iPS细胞系,应该进行筛查,以发现线粒体DNA突变。

Shoukhrat Mitalipov是国际上著名的干细胞技术应用于线粒体疾病治疗领域的专家,曾在2007年成功建立出灵长类动物猴子的克隆干细胞系,曾经入选《Nature》2013年度十大人物,也被称为克隆“酋长”和“线粒体狂人”。黄涛生博士早年毕业于福建医学院,1986年在第三军医大学获得硕士学位,博士毕业于美国西奈山医学院,现任美国辛辛那提大学、辛辛那提儿童医院终身教授,多项突破性成果被刊登在权威学术期刊上。

黄教授说:“人们只倾向于研究核基因组。但是,如果你想在一个人身上使用‘诱导多能性’细胞,你就必须检查线粒体基因组的突变。”

线粒体DNA包含支持基本需要的基因,如作为细胞的能源生产。虽然每个细胞储存着两份核DNA,在单个细胞中可能有一千份线粒体基因组的副本。这些副本都可能包含突变的和健康的线粒体DNA。黄教授说:“我们称之为斑点效应。每一个细胞可能都是不同的。彼此相邻的两个细胞,可能有不同的突变或不同百分比的突变。”

这些突变可以在“诱导多能性”细胞中被复制。在创建一个治疗性的iPS细胞系之前,要从患者身上收集一组细胞。这些细胞会进行突变检测。如果测试人员利用Sanger测序,这种旧技术不像新一代测序那样敏感,发生在不到百分之二十的样本中的任何突变,将不会被发现。但是,线粒体DNA突变可能发生在细胞库中不到百分之二十的线粒体中。因此,突变率尚不清楚。Mitalipov说:“这些线粒体突变实际上是隐蔽性的。”

但是在制备iPS细胞系的过程中,研究人员扩大了来自患者组织切片的单个细胞的克隆。在iPS细胞系中的每一个细胞,都将包含与最初成熟细胞相同的线粒体DNA突变。所以,Mitalipov和黄涛生博士不是研究一个iPS细胞系,而是从每个患者组织样本中获得了10个iPS细胞克隆,并进行了测序,以更好的理解线粒体DNA突变率。

他们采集了24岁到72岁之间的人群的血液和皮肤样本。当他们测试样品寻找线粒体DNA突变时,发现突变的水平很低。但是当他们对iPS细胞系进行测序时,他们发现了更高数量的线粒体DNA突变,尤其是在超过60岁的患者的细胞中。他们还发现,在一个细胞内含有突变的线粒体比例更高。一个细胞内突变的线粒体DNA含量越高,就对细胞功能的损害越大。

因为每个iPS细胞系是从一个不同的细胞制备而来的,因此,每一个细胞系可能包含不同类型的线粒体DNA突变和突变负载。为了选择受损最小的细胞系,作者建议筛查每个病人的多个细胞系。黄教授说:“这是一个好主意,检查iPS克隆寻找线粒体DNA突变,并确保你挑选到了一个好的细胞系。”

Mitalipov教授说,线粒体基因组相对较小,只包含37个基因,因此使用新一代测序筛选,应该可行的。这应该是相对便宜和办得到的。

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    Induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer an unlimited source for autologous cell replacement therapies to treat age-associated degenerative diseases. Aging is generally characterized by increased DNA damage and genomic instability (Garinis et al., 2008, Lombard et al., 2005); thus, iPSCs derived from elderly subjects may harbor point mutations and larger genomic rearrangements. Indeed, iPSCs display increased chromosome aberrations (Mayshar et al., 2010), subchromosomal copy number variations (CNVs) (Abyzov et al., 2012, Laurent et al., 2011), and exome mutations (Johannesson et al., 2014), compared to natural embryonic stem cell (ESC) counterparts (Ma et al., 2014). The rate of mtDNA mutations is believed to be at least 10- to 20-fold higher than that observed in the nuclear genome (Wallace, 1994), and often both mutated and wild-type mtDNA (heteroplasmy) can coexist in the same cell (Rossignol et al., 2003). Large deletions are most frequently observed mtDNA abnormalities in aged post-mitotic tissues such as brain, heart, and muscle (Bender et al., 2006, Bua et al., 2006, Corral-Debrinski et al., 1992, Cortopassi et al., 1992, Mohamed et al., 2006) and have been implicated in aging and diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and diabetes (Larsson, 2010, Lin and Beal, 2006, Petersen et al., 2003, Wallace, 2005). In addition, mtDNA point mutations were reported in some tumors and replicating tissues (Chatterjee et al., 2006, Ju et al., 2014, Michikawa et al., 1999, Taylor et al., 2003). However, the extent of mtDNA defects in proliferating peripheral tissues commonly used for iPSC induction, such as skin and blood, is thought to be low and limited to common non-coding variants (Schon et al., 2012, Yao et al., 2015). Accumulation of mtDNA variants in these tissues with age was insignificant (Greaves et al., 2010, Hashizume et al., 2015). Several point mutations were identified in iPSCs generated from the newborn foreskin fibroblasts, although most of these variants were non-coding, common for the general population, and did not affect their metabolic activity (Prigione et al., 2011). Somatic mtDNA mutations may be under-reported secondary to the level of sample interrogation. Here, we describe the accumulation of somatic mtDNA mutations revealed in multiple skin and blood iPSCs derived from 14 adult subjects as a function of age through whole mtDNA next-generation sequencing (NGS) (Table S1).

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