【“女神”新成果】Cell重要突破:首次利用CRISPR技术追踪RNA
生物通/何嫱 · 2016/03/20
基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法,靶向及追踪活细胞中RNA的活动。发布在3月17日《细胞》(Cell)杂志上的这一新方法,有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程,及操控基因转录进行疾病建模。


基因编辑工具CRISPR-Cas9现在可作为一种灵活、易使用的方法,靶向及追踪活细胞中RNA的活动。发布在3月17日《细胞》(Cell)杂志上的这一新方法,有可能最终可用于研究广泛的疾病相关RNA过程,及操控基因转录进行疾病建模。

论文的资深作者、加州大学圣地亚哥分校的Gene Yeo说:“我们才刚刚开始利用CRISPR技术看到基因组工程改造的影响,但许多的疾病包括癌症和自闭症都与另一种基本生物学分子RNA出现问题有关联。未来这项研究工作的进一步发展可以使研究人员能够检测RNA加工的其他特征,或支持一些治疗方法来纠正致病RNA行为。”

其他一些改造蛋白质来识别某些RNA序列的尝试一直缺乏特异性,且需要完成耗费劳力的程序操作。同时,称作为分子信标(molecular beacon)的短核酸仅限于成像应用,难于传送到细胞中。称作核酸适配体(aptamer)的蛋白质结合分子能够在活细胞中追踪RNA,但它们能够识别的RNA序列数量有限。

为了克服这些方法的局限性。Yeo和他的研究小组转而借助了CRISPR-Cas9,众所周知这一技术能够在各种生物中精确地编辑几乎所有的目的基因组位点。CRISPR-Cas9技术的特异性依赖于单向导RNA(sgRNA),sgRNA与Cas9酶形成的一种复合物可在靶DNA序列中生成突变。在这项新研究中,研究人员从几个方面改造了CRISPR-Cas9系统,优化它用于RNA追踪。

一种关键改造的灵感来自共同作者、加州大学伯克利分校Jennifer Doudna实验室过去的研究。2014年Doudna实验室的成员就曾经重新改造过酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9在试管中结合并切割RNA。Doudna研究小组还鉴别出了另一种由嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)生成的RNA靶向Cas酶。

基于Doudna的研究发现,他们设计出了一种叫做PAMmer的独特短核酸,使得Cas9能够在不损伤靶分子的情况下有效地识别RNA而非DNA。他们还利用了一种无催化活性的Cas9酶避免了切割转录组,并用一种荧光蛋白标记Cas9在显微镜下监测了RNA的活动。最后,他们利用一种优化的sgRNA改善了靶向RNA的效率。通过这些改造,这一技术能够在活细胞中追踪RNA,且不会改变RNA的丰度或翻译蛋白的量。

研究人员证实,他们的方法可用于追踪人类细胞中响应细胞应激的RNA活动。他们能够显像在应激颗粒(stress granule)中累积的特异RNA分子。应激颗粒是响应细胞应激由蛋白质与RNA组装而成的胞质颗粒结构,其与诸如肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病有关联。

当前,Yeo和他的研究小组正在探索除RNA定位外,RNA靶向Cas9改变和检测RNA加工其他特征的能力。未来进一步发展这种方法可以阐明与癌症和脊髓性肌肉萎缩症等神经退行性疾病,及脆性X染色体综合征等神经发育疾病相关的功能失调的RNA过程。

论文的第一作者、加州大学圣地亚哥分校的David Nelles 说:“这一技术的一个潜在应用就是随时间推移在病变神经元中追踪RNA运输,以鉴别出这些疾病的分子特征,支持开发出一些疗法。正如CRISPR-Cas9使得所有使用基础设备的科学家都能够实现遗传工程操纵一样,RNA靶向Cas9可以支持无数其他的努力来研究RNA加工在疾病中的作用,或鉴别出逆转RNA加工缺陷的药物。”

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  • Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9

    RNA-programmed genome editing using CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has enabled rapid and accessible alteration of specific genomic loci in many organisms. A flexible means to target RNA would allow alteration and imaging of endogenous RNA transcripts analogous to CRISPR/Cas-based genomic tools, but most RNA targeting methods rely on incorporation of exogenous tags. Here, we demonstrate that nuclease-inactive S. pyogenes CRISPR/Cas9 can bind RNA in a nucleic-acid-programmed manner and allow endogenous RNA tracking in living cells. We show that nuclear-localized RNA-targeting Cas9 (RCas9) is exported to the cytoplasm only in the presence of sgRNAs targeting mRNA and observe accumulation of ACTB, CCNA2, and TFRC mRNAs in RNA granules that correlate with fluorescence in situ hybridization. We also demonstrate time-resolved measurements of ACTB mRNA trafficking to stress granules. Our results establish RCas9 as a means to track RNA in living cells in a programmable manner without genetically encoded tags.

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