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Nature: 抗体正在误导科学界,重组抗体能否颠覆单抗、多抗时代?

2016/01/04 来源:生物探索
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导读
同一个抗体在几次平行实验里得出的结果不同,将会产生灾难性的结果,而导致这一结果却可能与抗体的生产过程有关。虽然抗体是生物科学领域的主力,但是它的可靠性一再让研究人员处于窘境。随着理解的加深以及技术的发展,学界和产业界通过多举措或将克服这一问题。


一大堆利用抗体标记神经递质(受体)的论文来袭,抗体正在误导科学界

1994年到2011年间,《比较神经学》(Comparative Neurology)期刊的主编Clifford Saper经常看到一大堆利用抗体标记神经递质及其受体位置的论文。2000年前后,基因敲除小鼠在生物领域大受欢迎,但结果令人不安。这提醒了Clifford Saper一个事实:抗体正在误导科学界

Clifford Saper先生现在是波士顿贝丝·以色列·迪肯尼斯医疗中心(Beth Israel Deaconess Medical Center,BIDMC)神经部门主席,根据他的回忆:理论上,基因敲除动物的染色结果应该和对照组小鼠的染色结果存在很大差别;但那时候他收到的论文中很多照片结果几近相同,于是乎越来越多的论文被撤稿。不过Saper团队也意识到,他们缺乏系统的方法来评估这些使用抗体的论文。

为此,Saper领衔了其所在的期刊进行革命并提出了要求作者提供论文中使用的抗体的广泛验证数据的原则。Saper在接受Nature采访时表示:尽管这条对文章的严谨性有很大好处,但对于论文的投稿与约稿不利,很多作者会觉得麻烦而选择投稿到其它杂志。但杂志社的坚持和努力最终形成了JCN抗体数据库——一个包含几千个可信赖的神经解剖学抗体的database。

处于困境的抗体市场:多抗、多抗、重组抗体孰优孰劣?


如今,科研者仍然不断遭遇抗体的悲剧。最常见的是:购买的用于检测蛋白X的抗体优先与蛋白Y结合(甚至可能完全不与X结合);可重复性差,用新抗体重复以前的实验,发现结果无法重复。一个好项目因此搁浅,抗体的不可靠性问题非常让人警醒。

同一个抗体在几次平行实验里得出的结果不同,将会产生灾难性的结果,而导致这一结果却可能与抗体的生产过程有关。特异性不足、敏感度和批次差异性等导致了错误的科研发现和大量的科研精力浪费;抗体的不可靠性造成了癌症、代谢、老化、免疫学和细胞信号转导以及任何研究复杂的生物分子的领域的巨大损失;因抗体而造成的、在时间和资源方面的浪费非常巨大。

多克隆抗体是通过收集经过目标抗原刺激动物获得免疫后的血液而制成的(只要这只动物还活着,就能够一直提供多克隆抗体);单克隆抗体是通过宿主动物接受目标蛋白免疫,然后提取出能识别并对该抗原发生响应的B细胞,使其与骨髓瘤细胞发生融合,从而成为可永久培养的细胞,从而不断产生目的抗体。

相比之下,重组抗体不同于传统的单克隆抗体,因为它们的制备不需要动物。相反,通过检测产生该抗体的基因序列(通过对动物的免疫细胞进行测序、或自己设定序列,检测产生的蛋白是否符合目标蛋白);再将该基因插入到合适的细胞株中,从而产生抗体。由于抗体是确定的,即使原始细胞株死亡或发生突变,也能通过基因插入,产生需要的细胞株。

位于蒙哥马利已有40多年销售多克隆抗体的经历的Bethyl Laboratories的首席科学官Eric McIntush表示:学界对重组抗体也会有需求,他们不可能把资金投入到可能永远不卖的产品中,因此公司计划从2016年起销售重组抗体。尽管多克隆抗体具有广泛可用性,是目前研发最便宜的抗体,适用于制备一些研究较少的抗体。但随着目标蛋白结构和功能的不断明确,以及临床转化的需求,重组克隆抗体也将大有可为。

瑞士苏黎世大学(University of Zurich)蛋白质工程学家Andreas Plückthu等人也认为,单克隆抗体和多克隆抗体最终会被“结构更明确”的重组抗体完全取代。他表示,许多蛋白质不能被现有的试剂识别,这是因为使用了结构不明确的多克隆抗体,因此他建议为什么不使用一些基因可识别或存储的试剂呢?

出于对抗体质量的追求,由2007年发起的Protein Capture Regeants和2010年发起的Affinomics两个公共基金资助的项目主要致力于检测市面上销售的抗体和蛋白结合试剂的质量。目前这两个项目都已接近尾声。结果显示:某些抗体尤其是转录因子的抗体质量格外参差不齐,这些试剂领域的后续投资会取得较高的回报率。

技术的进步和科学界的需求或将终结抗体乱象泥潭

抗体是生命科学领域最常用的工具之一,经常在 Western blot中揭示细胞或组织样本中特定蛋白质的表达量的多少。此外,抗体也被用于免疫组化和免疫荧光染色,以便于在显微镜下可视化地观察蛋白,以及其它各类基于抗体会与特定生物分子结合的实验。

数以百计的抗体供应商让人眼花缭乱

根据网上生物试剂商城Biocompare 2015年发表的一份报告:2015年科研用抗体市场规模达到25亿美金且该数据仍在增长。由于多克隆抗体能以多种方式靶向目标分子,不仅容易制造,而且在不同背景下都能特异性地识别目标蛋白,因此市场份额较大。一项调查发现,2006年以来10000篇生物医学论文引用了1293种多克隆抗体、755种单抗隆抗体和1种重组单克隆抗体。

据估计,每年因购买质量差的抗体导致的损失达到8亿美金,更不要说所造成的无数的错误结论、不可解释的(或曲解)实验,以及浪费了的病人样本和增加了的徒劳的研究时间。瑞典皇家理工学院的研究员Mathias Uhlén表示,因抗体而造成的挫败已经太多了,是时候做出改进了,科学界对解决这个问题怀有很大兴趣。

对抗体的不满意激励了各领域人士采取行动

2015年9月,Uhlén主持了由人类蛋白质组组织举办的抗体验证工作组成立大会。同月,美国实验生物学学会联合会主办的圆桌会议也探讨了抗体问题,预计明年年初发布抗体选择建议, NIH也参与了这次会议。从今年1月起,美国的基金分配将包含验证实验所需的抗体和其它关键资源质量的项目。只有这样,基金申请人和基金评委在描述如何认证材料时才将有据可依。

抗体验证工作组成立大会提出了一系列粗略的抗体重要标准草稿、评价体系以及验证方法:包括利用包括基因敲降(knockdown)和基因敲除来验证在目标蛋白缺乏的情况下,抗体是否仍会发生结合的方法;也包括把靶蛋白带上荧光标签、验证抗体是否会与未标记的蛋白发生结合的手段;包括把新抗体和质量好的抗体进行比较;包括通过质谱仪来检测分析抗体能与哪些分子结合;标准草稿将重点关注在特定实验、特定上下文中抗体的效果。


经过特殊设计,只有当两种抗体都结合于同一蛋白分子时,才会发出信号(红色)

CRISPR–Cas9等新技术有助于抗体质量的验证,拥有抗体验证数据成公司优势

抗体公司开始把有抗体验证的数据看成是一大竞争优势:一些抗体供应商发布了自己的验证结果,新的技术也将有助于抗体质量的验证。

英国的生命科学试剂供应商Abcam的首席执行官Alan Hirzel表示,为了验证出售的抗体的质量,其公司使用了可以精细调整DNA的CRISPR–Cas9基因组编辑方法;并计划在各种目标基因经CRISPR–Cas9技术切除的人类细胞系中验证抗体,然后把每个抗体的验证结果发布出来。

赛默飞世尔的首席科学官Klaus Lindpaintner表示:公司已经拥有能够验证抗体质量的技术,虽然在5-10年前他们根本没办法做到这点;

2015年6月,伯乐公司发布了一系列经过12种不同细胞系裂解物Western Blot实验验证的抗体;

2014年,抗体公司Proteintech利用小干扰RNA敲除基因的表达,然后验证每一个新抗体产品的信号是否随着蛋白表达的下降而下降。

NIH的抗体鉴定项目实验室主任Gordon Whiteley表示,抗体鉴定项目的目的是鉴别癌症生物学可靠的抗体清单,上述这些努力仍然不够,只有极小一部分公司愿意展开验证工作,并不是所有的公司都披露具体的测试条件,或何种情况下抗体的表现不佳,因此写明测试条件和测试结果同样重要。

抗体生产商Cell Signaling Technology公司的CSO Roberto Polakiewicz表示,检测抗体并没有最佳方法,开发抗体是一种科学试验,需要有专业的人士来验证抗体。倘若客户不能基于验证结果做出选择,他们会倾向于寻找一种新的抗体,且抗体在一个特定实验或特定样本中的表现良好,并不意味着它在其它实验里也能表现良好。

着眼现在:成立抗体验证平台收集重要信息

供应商要求使用者写试用心得、用户体验

加州大学的信息科学家、资源识别倡议项目(Resource Identification Initiative,RII)组长Anita Bandrowski指出:从其他研究者的论文中得到信息是最高效的方法;但问题是只有不到一半的实验论文具体描述了试剂使用的抗体货号;即使作者们写明了抗体货号,公司可能会停止出售该产品。RII倡议建立一个有助于独特的抗体识别体系,并说服几十种杂志要求作者明确地写明使用的抗体。


三种抗体(绿色)靶向同一线粒体蛋白质,右图显示了重组抗体与其他蛋白结合

目前已有十几个专门帮助研究人员选择抗体的网站,这些网站收集用户对抗体性能的评价,并提供比较工具:科学出版社F1000旗下网站Antibody Validation Channel,允许研究人员把自己在抗体购买网站上的账户贴出来,甚至还能请同行针对抗体结果给出意见和建议;Biocompare雇了一个内容编辑,专门联系研究者们,请他们对抗体写评价。

一些抗体供应商,如St John's Laboratory,为研究人员提供使用产品,要求使用者写试用心得;,抗体网上销售平台Antibodies-online安排了一个独立的、第三方机构对抗体进行验证;Antibodypedia网站的基因敲减计划于2016年9月推出,研究者届时可以通过抗体验证挣到几百美金:免费试用抗体,通过小干扰序列或CRISPR–Cas9等基因沉默技术来验证抗体的信号强度随着蛋白表达的下降而下降,然后把数据提交到网站,就可以获得网站奖励的几百美金。

展望未来:利用程序来评估抗体质量,提供抗体性能的定量信息

只有供应商开始提供抗体的验证数据,抗体质量才会有保障

国际结构基因组学联盟(Structural Genomics Consortium, SGC)主任、多伦多大学Aled Edwards教授和同事们使用质谱检测和比较1000多种抗体免疫沉淀的蛋白质,参考5个实验室、历时4年,花费了3百万美元(不含各种人士的好心捐赠)建立了一个程序来评估抗体质量和提供抗体性能的定量信息,尤其是蛋白沉降实验,即使用抗体将溶液中的目标蛋白沉淀下来。

挪威奥斯陆大学国家医院的蛋白组学专家Fridtjof Lund-Johansen正在开发一个高效的、可同时检测几千种抗体的磁珠试验法,或将细胞蛋白分离成许多不同的组分,然后用两种不同的方法对每个组分中的蛋白质进行检测分析:一种是质谱法(质谱数据作为参照,用于检测芯片结果);另一种是基于磁珠阵列、携带几千种抗体的芯片。

瑞典乌普萨拉大学的蛋白组学技术开发商Ulf Landegren表示,对抗体的全面评估可能被过分解读,他认为一种抗体与目标蛋白结合的能力远比讨论抗体是否能与正确的蛋白质以及其它分子结合有意义。当抗体结合非目标蛋白以外的蛋白时,有可能发生了交叉反应。由于与两种抗体都发生结合的分子不太可能代表非目标蛋白,研究人员与其仅仅依赖一个抗体,不如成对地检测能与同一目标蛋白不同部分结合的抗体。

然而,科学家们很难知道他们购买的抗体到底与哪个部分结合。供应商往往从不同来源获取产品,并且不需要披露原始制造商。正如Salk Institute的神经科学家Paul Sawchenko提醒的那样,供应商不能保证一个给定的抗体对每种组织样本都有效。除非碰巧有人在和你一样的样本、一样的实验条件下验证过该抗体的特异性,否则你需要自己去验证这个抗体到底有没有效。

综上所述,抗体市场监管不足,产品质量没有保障。只有当研究者们投入精力到抗体的选择上,供应商才会开始提供抗体的验证数据,抗体质量才有保障。

备注:本文原文来自nature网站,部分编译参考生命奥秘。

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