Nature Protocols:新型替代基因敲入技术
生物帮 · 2015/12/24
近日,来自广岛大学的研究人员在《Nature Protocols》上报告了一种利用基因组编辑技术的替代基因敲入方法的精简实验方案。这一创新方法被称作为PITCh系统。


近日,来自广岛大学的专任讲师Tetsushi Sakuma、Takashi Yamamoto教授,专任副教授Ken-Ichi T Suzuki及同事们在《Nature Protocols》杂志上,报告了一种利用基因组编辑技术的替代基因敲入方法的精简实验方案。这一创新方法被称作为PITCh系统。

基因敲入是通过用一种基因替换另一种基因,以便在体内测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗目的的技术。基因敲入通常是通过共同导入可编程核酸酶和单链寡核苷酸或是包含左右同源臂的靶向载体,诱导同源重组(HR)依赖性的基因添加来实现。

尽管同源重组介导的基因敲入能够精确插入大的DNA片段。构建靶向载体往往很费力,且在大多数培养细胞和生物体中同源重组活性都相对较低。这一问题为同源重组介导的基因敲入技术应用于生命科学领域设置了技术障碍。

相比于当前的方法,PITCh系统利用了TALENs 和CRISPR/Cas9技术借助微同源介导末端连接(MMEJ),能够更方便有效地将外源DNA插入到靶基因组位点中。这一新型的通用技术可帮助加快一些领域,如筛查候选新药及构建人类疾病细胞或动物模型的研究进展。

基因组编辑是一种在遗传工程中使用的创新技术,使得研究人员能够在特定的位点改造基因组。在这一技术中,研究人员利用了称作为“分子剪刀”的工程核酸酶来在基因组的预期位点造成DNA断裂。当一些修复信号通路修复DNA断裂时,可诱导包括将外源DNA插入到基因组中(基因敲入),和替代或移除靶基因组位点等遗传修饰。

Sakuma说:“不同于当前的一些采用TALEN或CRISPR-Cas9基因编辑工具的技术主要利用DNA断裂修复信号通路——同源重组,PITCH系统是一种独立于HR的替代基因敲入方法。由于可变的同源重组率,现有的基因敲入技术无法适用于所有细胞类型和生物。因此,我们瞄准了另一条修复通路——MMEJ,开发出了这一PITCh系统。”

在这篇文章中,作者们描述了构建理想载体,将它传染到细胞中,选择基因敲入细胞,及检查敲入的详细实验过程及一个真实的成功例子。此外,还描述了一种在青蛙胚胎中实现基因敲入的简单方法。这篇文章将允许研究人员很容易地使用这一强大的工具,并促成生命科学基础及应用研究的进展。

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  • MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems

    Programmable nucleases enable engineering of the genome by utilizing endogenous DNA double-strand break (DSB) repair pathways. Although homologous recombination (HR)-mediated gene knock-in is well established, it cannot necessarily be applied in every cell type and organism because of variable HR frequencies. We recently reported an alternative method of gene knock-in, named the PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) system, assisted by microhomology-mediated end-joining (MMEJ). MMEJ harnesses independent machinery from HR, and it requires an extremely short homologous sequence (5–25 bp) for DSB repair, resulting in precise gene knock-in with a more easily constructed donor vector. Here we describe a streamlined protocol for PITCh knock-in, including the design and construction of the PITCh vectors, and their delivery to either human cell lines by transfection or to frog embryos by microinjection. The construction of the PITCh vectors requires only a few days, and the entire process takes ~1.5 months to establish knocked-in cells or ~1 week from injection to early genotyping in frog embryos.

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