张锋公司Genome Biology发表CRISPR新成果
生物通/叶予 · 2015/11/30
Editas Medicine公司的研究团队日前在Genome Biology杂志上发表文章,详细阐述了金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)的特点和应用价值。该公司是CRISPR技术先驱张锋等人创立的,致力于通过基因编辑治疗人类疾病。


细菌一直在与病毒或入侵核酸进行斗争,为此它们演化出了多种防御机制,CRISPR适应性免疫系统就是其中之一。规律成簇的间隔短回文重复CRISPR与内切酶Cas9的组合,可以在引导RNA的指引下,靶标并切割入侵者的遗传物质。

近几年,人们将CRISPR系统开发成了强大的基因组编辑工具。该系统使用简单而且扩展性强,很快便受到了研究者们的广泛欢迎。几乎所有实验室都可以很方便的进行CRISPR基因组编辑,你只需要在自己感兴趣的细胞或生物中表达Cas9内切酶和引导RNA(gRNA)。内切酶Cas9会在gRNA的指导下引入位点特异性的双链断裂,然后细胞通过同源重组进行修复,最终改写基因组的特定位点。

迄今为止,绝大多数CRISPR研究使用酿脓链球菌的Cas9(SpCas9)。SpCas9已经被广泛研究并改良,成功用于多种模式生物和商业性生物。除此之外,人们也鉴定了其他细菌的Cas9核酸酶,比如嗜热链球菌、脑膜炎奈瑟菌和金黄色葡萄球菌。这些Cas9核酸酶的大小、序列要求和剪切效率都不尽相同。

Editas Medicine公司的研究团队日前在Genome Biology杂志上发表文章,详细阐述了金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)的特点和应用价值。该公司是CRISPR技术先驱张锋等人创立的,致力于通过基因编辑治疗人类疾病。

研究显示,SaCas9主要识别PAM序列NNGRRT,与引导RNA(gRNA)结合能够高效剪切目标DNA。研究人员建立了SaCas9切口酶,并用成对的gRNA进行功能分析。他们发现,D10A切口酶的活性比N580A切口酶强,诱导indel的频率可高达60 %。

SaCas9由1053个氨基酸组成,比SpCas9小。研究人员利用这一点将SaCas9与两个gRNA包装在一个腺相关病毒(AAV)载体上。GUIDE-seq分析表明,SaCas9造成的脱靶显著少于SpCas9。研究指出,SaCas9可以有效用于一系列基因组工程研究,并且具有不容忽视的优势。

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  • Characterization of Staphylococcus aureus Cas9: a smaller Cas9 for all-in-one adeno-associated virus delivery and paired nickase applications

    Background CRISPR-Cas systems have been broadly embraced as effective tools for genome engineering applications, with most studies to date utilizing the Streptococcus pyogenes Cas9. Here we characterize and manipulate the smaller, 1053 amino acid nuclease Staphylococcus aureus Cas9. Results We find that the S. aureus Cas9 recognizes an NNGRRT protospacer adjacent motif (PAM) and cleaves target DNA at high efficiency with a variety of guide RNA (gRNA) spacer lengths. When directed against genomic targets with mutually permissive NGGRRT PAMs, the S. pyogenes Cas9 and S. aureus Cas9 yield indels at comparable rates. We additionally show D10A and N580A paired nickase activity with S. aureus Cas9, and we further package it with two gRNAs in a single functional adeno-associated virus (AAV) vector. Finally, we assess comparative S. pyogenes and S. aureus Cas9 specificity using GUIDE-seq. Conclusion Our results reveal an S. aureus Cas9 that is effective for a variety of genome engineering purposes, including paired nickase approaches and all-in-one delivery of Cas9 and multiple gRNA expression cassettes with AAV vectors.

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