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新一代测序在农业领域大放光彩

2015/11/26 来源:生物通
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导读
普通农夫的谷仓里肯定没有最新款的HiSeq测序系统。不过,这并不意味着新一代测序(NGS)在农业领域就不如医学领域那么重要。


普通农夫的谷仓里肯定没有最新款的HiSeq测序系统。不过,这并不意味着新一代测序(NGS)在农业领域就不如医学领域那么重要。

乔治亚大学的特聘教授Andrew Paterson就利用NGS来捕获群体的多样性,他将基因型与参考基因组进行比较。他领导的植物基因组作图实验室也利用NGS从不同个体中获得许许多多的许可,“这样我们可以了解谁和谁关系比较近”。

不管是研究玉米,还是研究小鼠,传统的遗传学、分子生物学和生物化学、生物信息学以及其他学科中的许多技术都是一样的。然而,植物为研究人员带来了一些独特的挑战和机遇。

多倍体

植物可能携带了基因组的多个拷贝,比如说,面包小麦是六倍体,而甘蔗的拷贝数多达200个。“即使是四倍体,我们都很少有高质量的参考序列,更不用说六倍体了,”HudsonAlpha生物技术研究所的Jeremy Schmutz谈道。诚然,亚基因组之间有足够的差异,让你将大多数基因与每条染色体的不同特点相关联,但并非全部。Schmutz说,有很多东西,你无法说出它们从哪里来,到哪里去,因为有太多的拷贝。甘蔗就更不用说了。

通常情况下,人们对亲本或祖先种或者模式生物开展遗传学和基因组学分析。短柄草(Brachypodium)的基因组就特别小;它常作为小麦或其他草类的替身。“重测序小麦可能需要Illumina HiSeq X Ten的半个流动槽,这相当于5个人类基因组。而短柄草只有350 Mb,因此你可以尽情测序,”Schmutz说。你可以诱导突变,测定表型,如果你发现了一些有趣的,可以看看小麦中的相同基因做了什么。

参考呢

目前最优质的植物基因组是水稻基因组,这主要是因为“我们使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我们利用Sanger测序对每个BAC(细菌人工染色体)进行单独测序,”亚利桑那基因组研究所的Rod Wing教授谈道。这个基因组于2005年发表。

Wing还参与了玉米基因组的测序,这也是通过BAC-by-BAC开展的。不过那时,“我们没有足够的资金来完成每个BAC,因此唯一完成的是真正的基因部分,”Wing解释道。最近,人们利用短读取技术测序了基因组,产生了缺乏大部分非编码区域的基因组组装。

NGS的最大问题之一是短读取无法很好地对付重复片段,这可能占了基因组的一半。现在有一种技术能够很好地应对,南伊利诺伊大学的David Lightfoot教授谈道,那就是PacBio的长读取技术,它往往能够跨过重复区域。Lightfoot的研究团队正准备发表橄榄树基因组,这就是结合短读取和长读取测序的。

高分子量DNA

BAC、长读取测序、mate­pair文库构建,以及其他一些方法,都需要相对高分子量的DNA。“对于血液样本而言,这很容易获得,但是对植物来说有点难,因为它们积累了碳水化合物以及其他的代谢产物,可能降解DNA,”Schmutz说。此外,叶绿体可能贡献了10% 的DNA。最好去除它们,“这样你就不会一而再、再而三地把钱浪费在叶绿体的重测序上,”Lightfoot说。他使用了各种方法,包括在黑暗中育苗(这也能去除淀粉),从根部取样,或者使用现成的试剂盒来分离细胞核。

Wing的团队不依赖试剂盒,而是裂解并离心细胞,然后用温和的去污剂(如Triton™ X­100)重悬沉淀,裂解叶绿体和线粒体,但保持细胞核完整。“然后你就可以取出细胞核,纯化出高分子量的DNA,用于PacBio或长读取测序,”他说。为了制备BAC文库,他的团队将DNA嵌入低熔点琼脂糖中,创造出DNA多孔袋,让纯化DNA的酶和试剂可在其中扩散。DNA则永远不会受到任何剪切力。

新应用

目前,植物基因组学中的大部分经费都用来生成参考基因组。下一步是寻找作物的多样性,并查看它们的野生亲缘种。“在驯化过程中,你可能经历了消除所有变异的过程,不过事实证明,这种变异有望解决许多的农业问题,”Wing说。密歇根州立大学的Rebecca Grumet教授及其团队正在寻找葫芦科的抗病遗传标记(QTL),特别是西瓜、甜瓜、黄瓜和南瓜,这最终将帮助育种者轻松筛查抗病品种。遗传标记能帮助育种者混合多个性状,抵抗多种疾病,还能带来其他的优良性状。

她的团队是利用两种测序法基因分型(GBS)来实现的。第一种是基于双亲交配:将抗病株与敏感株杂交,查看后代。它们都有全基因组参考序列,因此能够找出性状所在的位置。第二种是GWAS:他们计划对每种作物的1000个种质资源进行测序,特别是它起源的区域。他们将利用这些信息来了解多少遗传多样性是来自那里,并建立核心种质。

此外,许多其他的NGS技术,比如RNA­Seq,也将在植物学研究中大显身手。如今测序已经扎下了根,而随着成本继续下降,新一代的研究人员更加熟练,它的应用必将开花结果。
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