Nature子刊:CRISPR助你一步制备新型gRNA文库
Ebiotrade · 2015/08/20
CRISPR­Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具,如风暴一般席卷了整个基因组工程领域。最近人们开始探索这一系统在其他方面的应用,而这样的应用往往需要同时表达一对gRNA,比如用Cas9切口酶进行大片段删除。


CRISPR­Cas9系统是一种强大的基因组编辑工具,如风暴一般席卷了整个基因组工程领域。最近人们开始探索这一系统在其他方面的应用,而这样的应用往往需要同时表达一对gRNA,比如用Cas9切口酶进行大片段删除。

纪念斯隆­凯特琳癌症中心的研究团队开发了一种简单又便宜的文库制备方法,可以快速有效的将配对gRNA克隆到表达载体上,用于体内和体外的功能筛选。这一成果发表在8月17日的Nature Communications杂志上,文章的通讯作者是纪念斯隆­凯特琳癌症中心的Andrea Ventura。

CRISPR/­Cas9是细菌在漫长的进化过程中演化出的重要防御机制。这个监控体系能够根据引导RNA(gRNA)的指示,靶标并降解入侵者的遗传物质。现在,CRISPR­Cas9已经成为了炙手可热的基因组编辑工具,帮助世界各地的研究者们解决实际问题。近年来,这一技术在多个领域中展现了自己强大的实力,催生了大量的重要成果。人们发现,同时表达内切酶Cas9与gRNA,可以诱导真核细胞发生双链DNA断裂。在真核生物中,双链DNA断裂主要通过容易出错的非同源末端连接进行修复,会在目标位点形成小indel(插入缺失)。因此,CRISPR­Cas9系统是破坏基因编码框的一种简单途径。研究表明,CRIPSR­Cas9可以高效靶标多个基因,实现大规模的功能缺失筛选。研究人员开发了一个快速制备配对gRNA文库的有效方法,大大拓展了CRIPSR在功能筛选方面的应用。该方法可以将寡核苷酸池中的一对gRNA克隆到任意CRISPR 表达载体上,还可以确保两个gRNA使用独立的启动子。

研究显示,一个慢病毒载体上的两个gRNA不适合使用相同的启动子。研究人员为此构建了新型慢病毒载体,搭载一个人类U6启动子和一个经过改良的鼠类U6启动子。这项研究为人们提供了一个简单、快速又便宜的配对gRNA文库制备法,大大拓展了CRISPR技术在功能基因组学研究中的应用前景。

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    The CRISPR-Cas9 system is a powerful tool to edit eukaryotic genomes that has recently been adapted for functional screens. Several of its applications—including the disruption of genes using Cas9-nickase and the generation of large deletions—require co-expression of two distinct guide RNAs (gRNAs). However, the lack of experimental approaches to generate pools of paired gRNA vectors prevents these applications from being scalable. Here we report a simple, inexpensive, one-step method that allows for the rapid and efficient cloning of gRNA pairs into expression vectors. We show that this method can be used to generate pooled libraries and is therefore suitable for in vivo and in vitro functional screens.

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