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Science:结构生物学不再混沌

2014/10/04 来源:lifeomics
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导读
随着研究人员不断地开发出更稳定的载物台、更好的显微镜抽真空技术,以及自动化的数据采集系统,这一切的技术进步都让我们能够获得更多、质量更好的电镜图像,结构生物学不再混沌。


图中展示的是构成酵母线粒体大核糖体亚单位(yeast mitochondrial large ribosomal subunit)的各个组成蛋白质。Amunts等人根据利用低温冷冻电镜技术获得的酵母线粒体大核糖体亚单位及完整核糖体的结构图谱,一个个地合成出了上述这些组分蛋白。这个经过不断完善的结果与根据X线晶体成像技术获得的原子模型非常吻合。

先进的低温冷冻电镜(cryo–electron microscopy)技术让我们获得了大量高分辨率的蛋白质结构图。

结构生物学(structural biology)研究的主要目的就是获得用于构成活体细胞的各种各样大分子(macro-molecules)生物组件的高分辨率图像信息。该研究主要依赖的技术手段就是X线晶体照相术(x-ray crystallography)以及核磁共振光谱分析检测技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR spectroscopy)。不过这两种技术都有各自的局限性,比如X线晶体照相术只能够对生长得极为有序的三维结晶进行观察,而核磁共振光谱分析检测技术则要求被检测样品的纯度非常高,不能够有重叠峰出现。有很多生物大分子相互结合、组装之后形成的都是非常大的,或者非常不稳定、比较罕见的结构,都不太适合用上述这两种技术进行分析和检测。单粒子电子显微镜技术(Single-particle electron microscopy, EM)则能够观察少量非结晶样品,获得高分辨率的结构图谱。

使用单粒子电子显微镜技术可以获得任意排列方向的分子复合体( molecular complexes)的结构图像。该技术会从每一幅图像中选出单个的复合体(粒子),然后借助计算机来判断它们的排列方向。最后将各个不同视角的图像组合在一起,得到该分子的三维立体图像。不过由于高能电子束会对生物大分子起到破坏作用,打断分子内的共价键(covalent bonds),并且诱发一系列级联式的有害化学反应,所以这种放射性损伤效应给单粒子电子显微镜技术带来了极大的局限性,在实验时用来记录影像的电子束的能量受到了非常大的约束。

20世纪80年代,Dubochet等人报道了一种单粒子电子显微镜技术革新成果,将该技术引向了高分辨率成像之路。他们在低温条件(cryogenic conditions)下将待检样品放在一层薄薄的、透明的冰上用单粒子电子显微镜进行成像观察。这种方法就是所谓的“低温冷冻电镜技术(cryo–electron microscopy, cryo-EM)”,他能够对含水的粒子(hydrated particles)进行直接成像。低温除了具有这些优势之外,还能够减少电子束对样品产生的放射性损害。不过电子束的照射量还是不能够太大,只有这样才能够清晰地反映出分子结构的细节,获得高质量的、低信噪比(signal-to-noise ratio, SNR)的三维结构图像。由于将每个分子的多张图像信息组合在一起能够更进一步地降低图像的信噪比,所以,对数万、乃至数百万个蛋白质复合体进行分析就会产生数十万张图像。

不过依靠低温冷冻电镜图像来判断生物大分子的结构给计算机处理分析工作带来了一大挑战。在借助多图像组合平均手段来改善信噪比时,必须知道每一颗粒子的方向,但是由于信噪比太低,我们对这些粒子方向的判断又明显感觉准确性不够,这就形成了一个矛盾。要解决这个问题,最成功的方法就是“重复(iterative)”,质量高的图像能够给出更准确的方向信息,而这些方向信息又可以帮助我们获得更高质量的图像。

直到最近这一段时间,绝大部分单粒子低温冷冻电镜图片的分辨率都非常低,连10埃都达不到,所以很多人都将这种技术嘲笑为 “一团浆糊学(blob-ology)”。蛋白质二级结构中的α螺旋(α helices)结构只有在分辨率达到9~10埃,甚至更高分辨率的情况下才能够看清;而另外一种二级结构,β折叠(β strands)结构则只有在分辨率达到4.8埃以上时才能够看清。达到3.5埃的分辨率,就可以为蛋白质或核酸等生物大分子构建原子模型(atomic models),将各种目前已知的核酸结构或氨基酸结构填入其中了。如果要了解蛋白质复合体形成时发生的各种化学变化,就必须获得原子级别分辨率的细节信息。低分辨率的结构信息也不是一无是处,当在与高分辨率结晶图像相互配合、印证,用来判断组成复合体的各种不同组分时更加有意义。因此,即便分辨率较低,低温冷冻电镜技术也还是帮助科学家们解决了很多生物学难题,比如解析出了与其他辅因子共同结合的核糖体的结构问题,以及构象只能够维持片刻时间的核糖体瞬时结构等问题。

在过去的三十年,低温冷冻电镜设备取得了长足的进展,在样品制备、成像、计算机处理等实验技术方面有了一定的提升,这些使低温冷冻电镜成像技术的分辨率有了极大的提高。高度连贯的场发射电子枪(Highly coherent field-emission electron guns)也使保留焦点以外的图像的高分辨率信息成为可能,这对于单粒子低温冷冻电镜非常有帮助。这种技术创新帮助科研人员获得了20面体病毒粒子(icosahedral virus particles)的图像,而且清楚地看到了其中的α螺旋结构。由于这种病毒是高度对称的,所以比较容易生成高质量的、最佳分辨率的低温冷冻电镜图像。

随着研究人员不断地开发出更稳定的载物台、更好的显微镜抽真空技术,以及自动化的数据采集系统,这一切的技术进步都让我们能够获得更多、质量更好的电镜图像,因此才能够得到高质量的、能够对其中的氨基酸侧链进行解析的二十面体病毒粒子三维结构图像,以及分辨率达到5埃的核糖体结构图像。不过在对更小一点的非对称粒子的解析工作中还是很难解析到α螺旋结构。

最近在低温冷冻电镜设备领域取得的最大进展就是引入了直接检测设备(direct detector device, DDD)照相机。这种DDD设备能够直接在传感器上记录图像,从而绕过了传统的、需要闪烁设备和光纤的电荷耦合装置(charge-coupled device, CCD)探测器,以及其他一些在用摄影胶片(photographic film)记录图像时必须要经过的繁杂的处理过程。因此,图像的信噪比也得到了极大的提升。在分辨率方面的提升也与之前的一些革新手段相当。在使用了DDD设备之后,还有可能在电镜图像中直接构建原子模型,甚至能够在最具挑战性的检测工作中进行α螺旋和β折叠的解析工作。

DDD设备的引入还在另外一个方面对低温冷冻电镜的图像起到了改善作用,凭借的就是该设备极快的读出速度(readout rate),该读出速度能够发现被冰包裹的被观测粒子在电子束中的运动情况。使用DDD设备不仅能够发现这种问题,还能够解决这种问题,因为现在的电镜就好像是一台摄像机,可以拍摄一段录影,记录整个过程,而不再像以前那样,只是一台照相机,只能够拍摄出一张张固定的图像。

有了高质量的图像,又有可以借助计算机对因为电子束而移位的粒子进行矫正的工具,我们就可以获得大量高质量的低温冷冻电镜图像,比如本文开头展示的那张分辨率高达3.2埃的线粒体核糖体亚单位图像,以及下图那张分辨率达到3.3埃的20S蛋白酶体图像和哺乳动物感受器通道TRPV1的图像。 TRPV1的图像尤其值得一提,因为TRPV1蛋白是一种膜蛋白,只有四级对称性(four-fold symmetry),比核糖体要小一个数量级。所以之前大家一直都认为很难用低温冷冻电镜对该蛋白进行结构解析的研究工作。有了 DDD成像技术、更好的计算机辅助和生物化学技术之后,Liao等人终于在某些区域获得了分辨率高达3.4埃的图像,从而有机会开展原子建模工作,在整个结构生物学(structural biology)发展历史上写下了重重的一笔。

单粒子低温冷冻电镜结构解析图。左图展示的是随机排列的蛋白质粒子在电镜下的图像,这些图像经过计算机处理之后可以用来计算大分子复合物的三维立体结构图像。由于有了DDD技术,左边的这些图像信息就可以构建出右图中展示的原子模型。图中展示的就是20S蛋白酶体的结构图。

乍一看上去,这些成果都好像是特例。比如核糖体里由于含有大量的RNA,所以是一幅高度紧缩的图像,非常紧密,不太容易受到辐射的损失。而20S蛋白酶体拥有14级对称性,所以也非常适于进行低温冷冻电镜成像操作。即便是TRPV1通道蛋白也都拥有一定的内部对称性。但是最近刚刚成功获得的一幅电镜图像就完全不具备上述这些“先天优势”,这就是分辨率达到4.5埃的人γ分泌酶复合物(γ-secretase)的结构图。人γ分泌酶复合物是一种更小的膜蛋白复合体,完全没有对称性。该成果说明,只要待测样品能够准备得恰当,尽可能减少其在结构上的异质性,我们就完全有可能利用低温冷冻电镜技术获得各种蛋白质的三维立体结构图。

这些科研新进展恰好出现在低温冷冻电镜技术的低谷期。最近刚刚获得的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型就引起了极大的争议,因为多位电镜专家都坚持认为,这个结构模型不仅在结构上不准确,就连用来进行分析的原始图像也都没有真实地反映该三聚体的真实信息。这场争论也让我们意识到,我们目前的确没有太多的手段对低温冷冻电镜图像的质量进行验证,虽然有一些手段,但是都没有得到广泛的推广和应用,另外也缺乏一套规范,图像的信号非常差,所以也很难判断最终得出的结构图是否就是被测样品的结构。这是一个非常值得关注的问题,不仅仅是因为这次的HIV-1病毒糖蛋白三聚体结构模型具有重大的科研价值,比如在HIV疫苗的开发工作中会起到非常重要的指导作用等。

在结构解析方面还有大量的工作需要我们去完善:方便使用的显微镜相板(phase plates)有助于更好地聚焦,获得高对比度的图像,就好像相衬光学显微镜(phasecontrast light microscopy)那样,这能够让对图像进行信息采集的工作更加简便,而且质量更高。另外在探测器方面也可以进一步提高图像的质量。即便是最先进的探测器也达不到符合理论要求的表现。各种用来进行图像分析的计算机软件,比如用来矫正电子束相关移位的软件,或者对各种粒子进行分类、解读的软件也将会变得越来越强大。新型的样品承载系统会进一步减少电子束对样品的位移作用。更加可靠的、更加强大的验证工具可以让我们更

有信心,保证不会纳入质量不高的原始图片素材。虽然现在还不知道低温冷冻电镜技术未来会走向何方,但是有一点是可以肯定的,那就是低温冷冻电镜图像绝对不再是一团浆糊了。

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