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华东师范大学Nature子刊发布CRISPR新文章

2014/09/29 来源:生物通
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导读
近日,发表在《Nature Protocols》杂志上的一项研究中,来自华东师范大学的研究人员通过将RNA直接注入到单细胞胚胎中,利用CRISPR/Cas系统构建出了多个基因突变的大鼠品系。


来自华东师范大学的研究人员通过将RNA直接注入到单细胞胚胎中,利用CRISPR/Cas系统构建出了多个基因突变的大鼠品系。这一重要的研究成果发布在9月25日的《Nature Protocols》杂志上。

华东师范大学生科院生命医学研究所刘明耀(Mingyao Liu)教授和李大力(Dali Li)副教授是这篇论文的共同通讯作者。前者主要从事G蛋白偶联受体(GPCR)在个体发育和重大疾病发生发展过程中的功能及信号转导机理研究,从而进行靶向新药研发。后者主要研究领域是结合分子生物学手段及转基因、小鼠基因敲除技术研究GPCR和组蛋白修饰酶的生物学功能。

基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但传统的基因敲除方法需要通过打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤,不仅流程繁琐、技术要求很高,而且费用大、耗时较长,成功率受到多方面因素的限制。

近几年来,科学家一直在寻求更加精确的基因组编辑方法。生物学家们发现,他们可通过添加一种切割DNA的核酸酶来提高这一过程的效率。锌指核酸酶(ZFN)通常用于将核酸酶递送到某一特定位点,然而由于锌指酶无法靶向每一种可能的DNA序列,限制了它们的应用。此外,组装这些蛋白也是一个费劳力的昂贵的过程。称作转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)的复合物,也可用于在特异位点切割基因组,但这些复合物同样昂贵,且难于组装。

CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR被分为三个主要类型,内切核酸酶Cas9属于研究最深入的II型CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas依赖于Cas9,通过单导向RNAs(single- guide RNAs,sgRNAs)可在特定的位点切割DNA。继ZFN、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后,CRISPR-Cas 技术成为可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法,且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点,在动物模型构建的应用前景将非常广阔。

在这篇文章中作者们报告称,通过将RNAs直接注入到单细胞胚胎中,他们利用CRISPR/Cas系统构建出了多个基因突变的大鼠品系,证实在大鼠中Cas9能够高效地介导基因编辑,同时生成复合基因突变体模型。

作者们详细描述了逐步构建出基因敲除(knockout)和基因敲入(knock-in)大鼠的程序。这一实验方案为我们提供了一份指南,如何来选择基因组靶点、合成导向RNAs、设计和构建同源重组(HR)模板载体、显微注射,以及在首建鼠(founder)和后代中检测突变及插入。从靶点设计到鉴别首建鼠只需要6周,其中不到10天是真正的动手工作时间。

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