威斯腾促销
第六届胶原蛋白行业论坛第一轮通知
安诺医学转录组,让科研与临床更近一步

自动化NGS文库制备的4点建议

2014/07/31 来源:生物通
分享: 
导读
随着测序费用的下降,新一代测序文库制备的费用已占了实验室测序经费的很大一部分。如今,在许多实验中,文库制备的费用几乎与测序相当。同时,制备文库也要花费相当多的精力。若是将这一过程自动化,不仅能够减少样品之间的可变性,而且能让此过程自动运行,无需人工干预。


随着测序费用的下降,新一代测序(NGS)文库制备的费用已占了实验室测序经费的很大一部分。如今,在许多实验中,文库制备的费用几乎与测序相当。同时,制备文库也要花费相当多的精力。若是将这一过程自动化,不仅能够减少样品之间的可变性,而且能让此过程自动运行,无需人工干预。

当然,大家都很清楚自动化的优点。不过,据Eppendorf应用支持部门的经理Jesse Cassidy介绍,开发一个自动化流程可比你想象得更加复杂。如果你已经习惯了手动构建NGS文库,那么在转换到自动化的液体处理平台时需要注意4件事。

1. 确保彻底重悬

文库制备操作通常涉及到一系列基于磁珠的结合和洗脱步骤。为了让这些步骤能正常进行,磁珠必须是均匀的悬浮液。虽然用手很容易让磁珠重悬,但有了自动化的系统,你就不需要费心。不过要保证磁珠在文库制备的每个阶段都重悬。在自动化的液体处理平台上,磁珠有可能聚集,如果这些团块不能适当重悬,则后续阶段的所有操作(洗涤和洗脱)都会失败。

Eppendorf的epMotion5075t自动化液体处理系统是NGS文库制备的好选择。5075t利用2D剧烈运动来优化沉淀的重悬,这允许极少量液体的均匀混合。传统的3D混合器需要在混合前密封容器,并在混合后离心,以收集全部液滴,而2D混合不需要这些操作,这意味着操作可以更快速地进行,而不会中断。

2. 去除所有洗涤液

去除洗涤液看似很简单,但也要当心,如果未设置好,液体处理器的吸头就不能放置在液面的正确位置。从太高吸取,吸头将无法触及反应孔的底部;从太低吸取,吸头将形成真空,因为容器底部的压力高。这两种情况都将形成“死体积”,进而抑制后续的洗脱,或影响文库的完整性。因此,用户必须监控自动化系统,手动干预,以去除洗涤后残留的液体。

在epMotion5075t平台上,一个弹簧调节的磁铁实现了与容器底部的自动接触。有了弹簧式的托板,吸头能够与容器底部接触,彻底吸空容器,同时避免孔内的压力导致真空形成,改善整体性能。

3. 最大限度回收模板

在利用少量材料制备文库时,当务之急是最大限度减少损失。低产量、大的洗脱体积会影响我们产生浓缩样品的能力。然而,所有磁珠都有一个回收阈值,这意味着一些模板将无法从磁珠中回收。

用户可以调整的一件事就是容器的形状。通过一些细节,如软件如何定义您的容器、软件在多大程度上识别容器的形状,以及它如何精确回收小的体积,用户能够控制洗脱回收的能力。在epMotion5075t上,容器尺寸都是精心计算和测试的,可确保高性能和均一性。

4. 优化反应孵育

最后,我们还要考虑测序反应的灵敏度。试剂体积、流量和温度的微小变化都会导致碱基的替换错误或不完全的延伸。大多数NGS化学处理(如连接和末端修复)都需要热孵育,以最大限度提高酶的效率。理想的情况是,所有反应孔都暴露在同一温度下,以避免样品之间的差异。例如,不均匀的加热可能导致某些孔的连接或末端修复的效率低下。

若液体处理系统使用线圈作为温控装置,则会带来许多这样的问题。epMotion使用Peltier驱动的加热和冷却模块,与大多数热循环仪相同,这使得各孔之间具有高度的均一性。Peltier技术避免了所谓的边缘效应。因此,这个文库制备系统可带来与PCR仪相当的温度控制和均一性。

NGS文库制备是个漫长而繁琐的过程,但自动化能够在很大程度上简化您的工作。精确的液体处理提高了被动和主动化学步骤的准确性,这对酶促反应是相当关键的。十年前,自动化文库制备的市场仅限于高通量的核心实验室。今天,当个人测序仪变得更加实惠,低通量的用户也越来越多地享受到这些好处。有了Eppendorf的epMotion系统,文库制备比以往都要简单得多。

本网站所有注明“来源:生物探索”的文字、图片和音视频资料,版权均属于生物探索所有,其他平台转载需得到授权。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(editor@biodiscover.com),我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点,不代表本站立场。