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MSCs分化为矿化的成骨细胞

2010/11/25 来源:武汉原生原代生物医药科技有限公司网站
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导读
MSCs分化为矿化的成骨细胞 试剂和材料: 完全培养基(CCM):α-MEM:α-低限量基础培养基,含谷氨酰胺,无核苷酸或脱氧核苷酸;添加:20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化,非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃

MSCs分化为矿化的成骨细胞

试剂和材料:

完全培养基(CCM):α-MEM:α-低限量基础培养基,含谷氨酰胺,无核苷酸或脱氧核苷酸;添加:20%附加L-谷氨酰胺 2mmol/L、经FBS杂交瘤纯化,非热灭活、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml。过滤除菌。储存于4℃,不超过2周;

BDM(骨分化培养基):CCM包含5mmol/L β-甘油磷酸,50μg/ml抗坏血酸-2-磷酸和1nmol/L地塞米松。过滤除菌;

PBSA;

胰蛋白酶/EDTA;

聚丙烯离心管,15ml和50ml;

组织培养皿,6孔,孔面积为9.6cm2;

ARS:蒸馏水配制1%ARS,用0.5N氢氧化氨调节pH值到4.1,过滤除菌;

福尔马林缓冲液,10%;

改良的Neubauer血细胞计数器;

实验方法:

从单层细胞中收集MSCs;

向6孔培养板的每个孔中加入2ml CCM,共有1×104个细胞(适用于人或大鼠)。最终密度约1×103个细胞/cm2;

将上排3个孔标记为“成骨”,下排3个孔标记为“阴性”;

在37℃,5%CO2环境下孵育,每隔两天更换一次培养基,直到细胞达到7.%―80%汇合;

达到所需的细胞密度时,从孔中吸出完全样机,向6孔培养板上排的孔中加入2ml BDM,向下排的孔中加入2ml CCM;

在37℃,5%CO2环境下孵育,每隔两天更换一次培养基。ARS检测时,于21天对细胞进行染色;

从培养箱中取出分化后的MSC,每孔中的单层细胞用2ml PBSA润洗两次;

每孔中加入2ml福尔马林,室温固定单层细胞10min;

吸出福尔马林,每孔中加入2ml PBSA润洗两次后,再用2ml蒸馏水润洗一次;

加入2ml ARS溶液,室温孵育30min;

过量蒸馏水润洗各孔,直到“阴性”孔中的背景染色最大限度地清除;

用显微镜观察标记为“成骨”的单层细胞评价深红色的程度。成骨分化达到令人满意的水平时,单层细胞ARS着色面积超过50%。此时,单层细胞可在4℃水中最多存放7天。或者,ARS可从着色的单层细胞中提取出来,用先前描述的方案进行测定;

来源:武汉原生原代生物医药科技有限公司

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