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microRNA药物研发的现状与挑战

2014/07/14 来源:疑夕
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导读
三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、AstraZeneca、Servier引领全球microRNA药物研发,目前已有miR-122、miR-34两个靶点进入临床研究阶段,病毒感染、癌症、心脏病、糖尿病等多个适应症在研。

Regulus Therapeutics、Mirna Therapeutics、miRagen Therapeutics三家生物技术公司携手制药界土豪Sanofi、AstraZeneca、Servier引领全球microRNA药物研发,目前已有miR-122、miR-34两个靶点进入临床研究阶段,病毒感染、癌症、心脏病、糖尿病等多个适应症在研。

关于microRNA的基础知识不再赘述,参考本科分子生物学教材。

1. 抑制miRNA的方法

(1) miRNA诱骗剂

miRNA诱骗剂(miRNA sponge)是使用一段人造的含多个miRNA结合点的mRNA,诱骗miRNA与之结合从而表达目标mRNA。这种方法在研究miRNA功能的体外实验中有广泛应用,但在体内的应用极其有限,主要通过转基因动物在靶组织中过度表达miRNA诱骗剂。

(2) 反义核酸

针对RNA靶点最常用的手段就是反义核酸,反义核酸通过与miRNA高度互补,可以组断miRNA与目标mRNA结合。反义核酸是很难直接用于体内的,它们很难直接穿透细胞膜,需要经过化学修饰改善PD/PK。

(3) 小分子抑制剂

miRNA涉及多个生物化学步骤,可以筛选小分子抑制剂,干扰miRNA的表达和功能的实现。比如有文献[1,2]报道了抑制miR-21和miR-122的小分子,但EC50在微摩尔级,而且缺乏直接靶点的信息,因此应用潜力仍然非常有限。

2. 反义核酸的化学修饰

(1) 2ʹ- O-甲基化

将核苷酸2’-位的羟基甲基化是一种常见方法,可以提高寡核酸对核酸酶的耐受性。2004年的两篇篇论文中[3,4],作者分别用一段31个核苷酸、24个核苷酸长度的甲基化RNA抑制miRNA和siRNA的功能。尽管甲基化修饰提高了寡核酸的稳定性,但仍然不能避免被血清中的核酸外切酶降解,因此不适用于体内。

(2) 硫代磷酸

由于核酸外切酶切割的是两个核苷酸之间的磷酯键,因此将磷酸基团上的一个氧原子替换为硫便能提高稳定性。硫代磷酸修饰的寡核酸增强了与血浆蛋白、细胞表面的亲和力,能够在1-2个小时内从注射部位吸收进入血液,而且能够被肝、肾、脾、淋巴结、脂肪组织、骨髓摄取。但这种修饰会降低对miRNA的亲和力,全硫代磷酸修饰的反义核酸完全没有miRNA抑制活性,因此只能选择性替换部分磷酯键。

(3) 2ʹ- O-MOE修饰

2’-位甲氧基乙基化在对miRNA的亲和力和对核酸酶的耐受性上都优于2’-位甲基化,2008年的一篇论文中[5],作者用2ʹ- O-MOE修饰的寡核酸抑制了miR-143,从而增加了目标基因的表达,这证明了2ʹ- O-MOE修饰相对于2ʹ- O-甲基化的优势。

(4) 2ʹ-F修饰

将核苷酸2’-位的羟基替换为氟,可以将糖环锁定为3ʹ-endo构象,产生优越的亲和力,每个核苷酸片段大约增加Tm值2-3 oC。但单纯的2ʹ-F修饰是不耐受核酸酶的,必须用硫代磷酸连接才能在血清中实现较好的稳定性。

(5) 锁核酸

锁核酸是将2’-位的氧与4’-位的碳通过亚甲基连接起来,形成双环核苷酸,同时将糖环锁定为3ʹ-endo构象。这种修饰既能增加对核酸酶的耐受性,又能大幅增加对miRNA的亲和力,每个锁核酸片段大约增加Tm值4-6 oC。锁核酸性能优越,5 nM剂量下即可抑制miRNA,联合其他方法如2ʹ-F修饰,有效性可进一步增强。

3. 体内给药策略

(1) 缀合物

虽然化学修饰一定程度上改善了反义核酸的亲和力和稳定性,但缺乏载体的情况下组织分布有限,容易被肝肾摄取,很快经尿液排出体外。体内给药的一种策略是缀合物修饰,比如在3’-端接上胆固醇,这样就能混进高密度脂蛋白中,输送到肝、肾、肠及类固醇器官。

另一种方法是在5’-端接上维生素E,这可以有效地将siRNA输送到肝脏[6],从而敲除ApoB的表达,小鼠只需要给药2 mg/kg,而如果缀合胆固醇,需要的剂量高达50 mg/kg。最近文献报道siRNA缀合SPACE肽[8],有助于穿透角质层,因此通过皮肤给药也有可能。

TLR9 (Toll-like receptor 9)是CpG DNA的内源受体,因此可以缀合CpG DNA,从而靶向表达TLR9的细胞,这被用于沉默TLR9+骨髓细胞、B细胞中的转录因子STAT3[7],从而增强抗肿瘤免疫应答。

(2) 脂质体

2005年Morrissey报道了应用脂质体输送siRNA的方法[9],将siRNA用PEG脂质体包裹起来,用于阻断小鼠体内HBV的复制,剂量为3 mg/kg,远远低于裸露的siRNA,随后脂质体在核酸的给药中得到广泛研究。

特别值得一提的是GalNAc-PEG脂质体[10],通过N-乙酰半乳糖(GalNAc)与细胞表面的半乳糖特异性受体ASGPR结合,可以实现肝靶向,有效剂量甚至可以是0.02 mg/kg。还有一种是在脂质体中引入透明质酸和整合素抗体[11],这样可以将siRNA靶向白细胞,沉默cyclin D1的表达。

(3) 纳米粒

10-100 nm的纳米粒能够输送小分子、siRNA、anti-miR,早期的研究采用聚乙烯亚胺纳米粒,缀合PEG和结合整合素的Arg-Gly-Asp肽,形成polyplexe输送siRNA进入肿瘤[12]。但这种纳米粒只有中等程度的抗肿瘤活性,可能是由于未经修饰的siRNA被降解了。

后来文献报道采用环糊精-PEG缀合物,铁传递蛋白作为靶向肿瘤的配体,成功将siRNA输送到表达EWS–FLI1的Ewing's肉瘤[13]。后来这一纳米粒系统还进行了I期临床试验(NCT00689065),这也是全球首个siRNA临床试验[14],证明RNA干扰确实能敲除实体瘤患者目标基因。

Baigude设计了脂官能团化赖氨酸骨架[15],形成纳米粒用于输送siRNA,沉默ApoB基因,这种方法后来被用于输送miR-122反义核酸[16]。

(3) 抗体制导

抗体由于高亲和力和高特异性,也被用于siRNA和anti-miR的体内输送。2005年报道的F105-P是将精蛋白与HIV-1包膜抗体融合[17],精蛋白可以结合siRNA,用这种方法可以将siRNA靶向HIV-1包膜阳性的细胞。

后来从抗体扩展到了单链可变区片段(scFv),采用CD7特异性的scFv缀合碱性多肽[18],输送siRNA沉默CCR5。类似的还有HBV表面抗原特异性的scFv缀合精蛋白,HER2特异性的scFv缀合精蛋白。

4. miRNA靶点

(1) miR-122与HCV感染

miR-122是2005年鉴定的肝特异性miRNA,能够调节HCV的复制,因此抑制miR-122可能治疗HCV感染。Santaris Pharma开发的miravirsen目前处于II期临床,它是基于锁核酸技术的反义药物,对miR-122亲和力较高(Tm为80 oC)。I期临床显示耐受性很好,未发现剂量限制性毒性,这有望成会成为首个针对miRNA反义核酸获批。而Regulus Therapeutics开发的RG-101则是采用缀合GalNAc的方法,目前已进入I期临床。

(2) miR-34、let-7、miR-21、miR-221与癌症

2004年人们首次将miR-34 (miR-34a, miR-34b, miR-34c)与癌症联系到一起,它能抑制一系列癌基因如CDK4/6、E2F3、Myc、HDAC1、Bcl-2、SIRT1、Wnt、MTA2,多种肿瘤miR-34下调。Mirna Therapeutics开发的MRX34是一种miR-34脂质体,补充miR-34治疗肿瘤,临床前结果显示优于索拉非尼,目前已进入I期临床。

let-7是最早发现的miRNA,调节线虫的发育过程,2004年发现let-7下调与肺癌生存期相关[19],后来发现let-7介导了对RAS的抑制,let-7下调也会增加HMGA2的表达。Let-7可抑制多种癌细胞的生长,特别是KRAS突变的细胞,Mirna Therapeutics正在开发miR-Rxlet-7,目前处于临床前。

2006年文献报道大多数肿瘤miR-21过量[20],miR-21能够抑制多种抑癌基因如PTEN、TPM1、PDCD4,抑制miR-21可促进肝癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤细胞死亡。另外miR-21上调还会促进心脏、肾脏纤维化,Regulus Therapeutics开发了RG-012抑制miR-21,计划2014年启动I期临床。

2008年文献报道人肝细胞癌中miR-221上调[22],这种miRNA控制着p57、p27、Bcl-2修饰因子的表达。Regulus Therapeutics与Sanofi合作开发针对miR-221的药物,目前处于临床前研究。

(3) miR-208、miR-195与心脏病

miR-208是在心脏中高度表达的一种miRNA,敲除miR-208的小鼠发育正常,但心脏逐渐失去功能,而且负荷过大也不会出现心肌肥大。miRagen Therapeutics开发了miR-208反义核酸[21],用于治疗高血压引起的心力衰竭,不过剂量有些偏高,达到了25-33 mg/kg,目前处于临床前。

miR-195属于miR-15家族,是心脏发育过程中的一种重要miRNA,调节心肌细胞的增殖,胚胎心脏miR-195过量会导致心室发育不良、中膈缺损。miRagen Therapeutics与Servier合作开发针对miR-195的反义核酸,用于治疗心肌梗死,目前处于临床前。

(4) miR-103、miR-107与糖尿病

2011年的一篇Nature报道了miR-103、miR-107与胰岛素敏感性的关系[22],ob/ob小鼠和DIO小鼠的miR-103、miR-107上调,沉默miR-103、miR-107可改善葡萄糖稳态和胰岛素敏感性。Regulus Therapeutics与AstraZeneca合作开发针对这个靶点的药物,目前处于临床前研究。

5. 研发miRNA疗法的挑战

(1) 杂交相关的脱靶效应

目前miRBase中已经收录了人类的2578种miRNA,许多miRNA序列相似,比如miR-17与let-7家族。同一个miRNA家族类的成员通常很难区分,2’-O-甲基化修饰的miR-93抑制剂能够抑制其他家族成员如miR-106b [23]。

(2) 杂交无关的脱靶效应

免疫系统天生就有TLR (Toll-like receptor),溶酶体受体TLR3、TLR7、TLR8、TLR9能够识别细菌、病毒源的RNA和DNA,核酸药物可能刺激免疫系统,产生严重的免疫毒性。尽管化学修饰可以增加寡核酸的亲和力和稳定性,但也可能带来序列无关的毒性。

(3) 怎么给药

这是困扰所有核酸类药物研发的问题,核酸本身呈酸性,在血液中极不稳定,也不太容易穿透细胞膜。怎么将药物从体外送进细胞是个难题,怎么将药物靶向到病变组织避免全身毒性也是个问题。

今年4月份,前Pfizer全球研发总裁John LaMattina与Alnylam首席执行官John Maraganore争论这个问题,AstraZeneca则是悬赏10万美元征求寡核酸如何给药的意见。如果有一天药物输送问题真的解决了,RNA会成为继小分子、蛋白质后第三大类药物吗?

[1] Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008, 47, 7482-7484.

[2] J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 7976-7981.

[3] PLoS Biol. 2004, 2, E98. Doi: 10.1371/journal.pbio.0020098.

[4] RNA. 2004, 10, 544-550. Doi: 10.1261/rna.5235104.

[5] Methods. 2008, 44, 55-60.

[6] Mol. Ther. 2008, 16, 734-740.

[7] Nature Biotech. 2009, 27, 925-932.

[8] Proc Natl Acad Sci USA. 2011, 108, 15816-15821.

[9] Nature Biotech. 2005, 23, 1002-1007.

[10] Mol. Ther. 2010, 18, 1357-1364.

[11] Science. 2008, 319, 627-630.

[12] Nucleic Acids Res.2004, 32, e149.

[13] Cancer Res. 2005, 65, 8984-8992.

[14] Nature. 2010, 464, 1067-1070.

[15] ACS Chem Biol. 2007, 2, 237-241.

[16] Nucleic Acids Res. 2011, 39, e38.

[17] Nature Biotech. 2005, 23, 709-717.

[18] Cell. 2008, 134, 577-586.

[19] Cancer Res. 2004, 64, 3753-3756.

[20] Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 103, 2257-2261.

[21] Circulation. 2011, 124, 1537-1547.

[22] Nature. 2011, 474, 649-653.

[23] EMBO J. 2011, 30, 823-834.

Ref: Nat Rev Drug Discov. 2014, doi: 10.1038/nrd4359.

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